新型冠状病毒与实时荧光RT－PCR核酸检测＊

郭晓波，蔺 京，来春艳，张养民，龚卫锋，史 敏，杨瑞利

1.西安市中心医院血液科（西安710004）；2.西安市中心医院控感科（西安710004）；3.西安市中心医院输血科（西安710004）；4.西安培华学院医学院（西安710065）；5.西安长安医院检验科（西安710016）

新型冠状病毒（世界卫生组织已将其命名为“2019 novel Coronavirus，2019－nCoV，即2019新型冠状病毒”）是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株［1－4］，目前，已知的冠状病毒有6种，其中4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状；另外2种是SARS冠状病毒和MERS冠状病毒，可引起严重急性呼吸综合征和中东呼吸综合征。此次发现的新型冠状病毒与SARS和MERS冠状病毒有很大不同。新型冠状病毒肺炎临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现，鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒征休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重症、危重患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1周后恢复；多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡［5－7］。本文就新型冠状病毒的病原学特点及其与实时荧光RT－PCR核酸检测间的关系进行综述。

1 新型冠状病毒及其病原学特点

冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）。根据血清学和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属。已知感染人的冠状病毒有6种，包括α属的229E和NL63、β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒（MERSr－CoV）和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARSr－CoV）。此次从武汉市不明原因肺炎患者下呼吸道分离出的冠状病毒为一种属于β属的新型冠状病毒［8］。冠状病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多行性，直径60～140nm。S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。其基因特征与SARS－CoV和MERS－CoV有明显区别。目前的研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat－SL－CoVZC45）同源性达85%以上。体外分离培养时，2019－nCoV 96h左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在Vero E6和Huh－7细胞系中分离培养需约6d［9］。

对冠状病毒理化特性的认识多来自对SARSCoV和MERS－CoV的研究。病毒对紫外线和热敏感，56℃30min、乙醚、75%酒精、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒，氯已定不能有效灭活病毒［10］。

2 新型冠状病毒实时荧光RT－PCR核酸检测

按照最新指南，利用荧光RT－PCR检测新型冠状病毒核酸阳性仍然是确诊的金标准。新型冠状病毒实时荧光RT－PCR核酸检测基本原理，是根据病毒的核酸序列设计特异性的引物用于扩增对应的核酸片段，同时高度特异性的Taq Man探针可与对应的核酸片段进行结合，并在Taq酶外切酶活性作用下发生水解，产生荧光信号，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可得到实时扩增曲线。标本处理前必须进行56℃30min病毒灭活预处理，方可进行后续处理。样本选择原则，尽量采集病例发病早期的呼吸道样本（上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等）。轻症病例优先采集咽拭子和痰液，重症病例优先采集肺泡灌洗液。所有标本应放在大小适合的带外螺旋盖的、有垫圈的、耐冷冻的样本采集管理，拧紧。容器外注明样本标号、种类、姓名及采集日期。将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封。标本采集后，按相关要求立即送往实验室。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24h内能检测的标本可置于4℃暂时保存，24h内无法检测的样本则应置于－70℃或以下保存。如无－70℃保存条件，则于－20℃冰箱暂存，标本避免反复冻融。目前各大商业公司试剂盒中以2019－nCoV的RdRP基因（位于ORF1ab读码框）、E基因和N基因为检测对象，从而实现对2019－nCoV核酸的检测［11］。在质控品正常的情况下，2019－nCoV的RdRP、E、N基因结果判断见表1，2019－nCoV核酸检测阴、阳性结果判断见表2。

表1 2019－nCoV的RdRP、E、N基因结果判断

表2 2019－nCoV的阴、阳性结果判断

3 新型冠状病毒肺炎诊断

新型冠状病毒性肺炎的诊断依据目前主要为流行病学、临床表现、实验室检查、胸部影像学。流行病学史是发病2周内有武汉市旅游史或居住史；或发病前14d内曾经接触过来自武汉的发热伴有呼吸道症状的患者；或有聚集性发病；或与新型冠状病毒感染者有接触史。新型冠状病毒感染者是指病原学核酸检测阳性者。胸部影像学的特点是早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显。进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，胸腔积液少见［12］。临床表现是发热和（或）呼吸道症状；或具有肺炎影像学特征；或发病早期白细胞总数正常或降低，或淋巴细胞计数减少。实验室检查是发病早期外周血白细胞总数正常或减低，淋巴细胞计数减少，部分患者出现肝酶、LDH、肌酶和肌红蛋白增高。部分危重者可见肌钙蛋白增高。多数患者C反应蛋白和血沉升高，降钙素原正常。严重者D－二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少［13］。凡符合疑似病例标准的基础上，痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等标本行实时荧光RT－PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源，便可确诊为新型冠状病毒感染。因此，对发热病人或者疑似新型冠状病毒感染的患者进行实时荧光RT－PCR核酸检测，可以早发现、早诊断、早治疗或尽早与其他病毒感染者进行鉴别诊断。

4 小 结

新型冠状病毒（2019－nCoV）在中国武汉发现，传播迅速，目前已在多个国家出现确诊病例。核酸PCR检测是肺炎病原学检测方法之一，实时荧光RT－PCR核酸检测方法，灵敏度高，特异性强，可以快速准确的对新型冠状病毒进行检测，为临床早发现，早诊断、早治疗提供重要依据。