P53、bFGF、PTEN 在湿热型大肠管状腺瘤患者中的表达强度研究

陈小玲，付肖岩，林建龙，林巧云，伍登煇，林芳峰

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州350003）

大肠管状腺瘤是腺瘤中最主要的一种，也是公认的癌前病变，相关数据显示其癌变的转化率高达4%～4.8%［1］。 管状腺瘤的发生、发展过程伴随着一系列基因蛋白表达的变化，其中突变型P53 蛋白（P53）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、抑癌基因（PTEN）均参与了细胞增殖、凋亡及血管生成，被证实与多种包括肠癌在内的恶性肿瘤发病相关。 本课题旨在通过检测湿热型大肠管状腺瘤患者以及肠镜检查未见异常的健康者中P53、bFGF、PTEN 表达强度的差异，并探讨三者在不同上皮内瘤变（IN）程度中表达强度的不同。

1 临床资料

1.1 西医诊断标准 管状腺瘤、IN 程度的判定标准参照《消化系统肿瘤WHO 分类》（2012 年）中的相关标准［2］，其中IN 程度分为低级别上皮内瘤变（LGIN）和高级别上皮内瘤变（HGIN）。

1.2 中医辨证标准 参照国家中医药管理局重点专科协作组制定的“大肠息肉诊疗方案”［3］辨为湿热证。主证：①腹痛拒按，胀满不适；②大便溏泄或黏液便；③泄下不爽而臭秽；④大便秘结；⑤便血；⑥舌质偏红，舌苔黄腻，脉弦滑或滑数。 次证：①口干喜饮；②口苦；③肛门灼热坠胀；④里急后重；⑤小便短赤或黄；⑥头身困重。 诊断需具备主证至少2 项＋次证至少2 项。

1.3 纳入标准 ①年龄30～70 岁；②自愿加入研究并签署知情同意书者。

1.4 排除标准 ①病理确诊管状腺瘤伴癌变或患有其他系统肿瘤者；②伴有明显其他肠道疾病者；③妊娠、哺乳期妇女，或有心、肺、肾等重要脏器疾病者；④兼杂证型或无证可辨者。

1.5 一般资料 随机选取2018 年2 月—2019 年10 月于我院消化内镜室行电子结肠镜检查确诊为湿热型大肠管状腺瘤患者50 例为试验组，另随机选取20 例肠镜检查未见异常的健康者为正常组。试验组男33 例，女17 例，年龄（55.82±6.76）岁，其中HGIN 者（HGIN 组）22 例，LGIN 者（LGIN 组） 28例。 正常组男9 例，女11 例，年龄（53.30±4.97）岁。

2 方 法

2.1 主要仪器及试剂 电子肠镜（日本Olympus 公司，型 号：CF-H260AI）；高 频 电 刀（德 国ERBE 公司，型号：ICC200）；染色机（美国Leica 公司，型号：ST5020）；Olympus 显微镜（日本OLYMPUYS 公司，型号：BX43）；湿盒、鼠抗人P53 单克隆抗体、兔抗人bFGF 多克隆抗体、兔抗人PTEN 多克隆抗体、DAB 显色试剂（福州迈新生物技术开发有限公司）。

2.2 标本采集 试验组采集湿热型大肠管状腺瘤患者电切术后瘤体为标本，正常组以活检钳钳取距肛约10～15 cm 处的肠黏膜组织为标本。

2.3 免疫组织化学检测步骤 先将组织包埋、切片（2～3 μm）、制片，放60 ℃烤箱中烘烤1 h 后浸泡在松节油中脱蜡；然后逐次放入无水乙醇、90%酒精、85%酒精、蒸馏水中各10 min；约2 L 枸缘酸缓冲液加入高压锅中，加热沸腾后放入切片，然后加阀加热1～2 min，流水冷却压力锅后再用蒸馏水冲洗切片；滴加过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10 min，PBS 缓冲液冲洗3 次；除去PBS 缓冲液后，于两张玻片上分别滴加适当量的P53、bFGF、PTEN 抗体，置于室温下孵育60 min；后同样用PBS 缓冲液反复冲洗3 次，取出玻片，保存于湿盒中；滴加二抗，室温下孵育15～30 min 后，用PBS 缓冲液反复冲洗3次；滴加适度DAB 工作液后，室温中孵育3～5 min，显色完全后蒸馏水冲洗终止显色；用苏木精复染30 s～2 min，后将组织玻片浸入梯度酒精（75%～100%）中脱水，每级时间控制2 min；最后行透明、封片、摄片。

2.4 P53、bFGF、PTEN 表达强度判定 P53、PTEN定位于细胞核，bFGF 主要定位于细胞核，部分定位于细胞浆，均以清晰棕黄显色为阳性。 采用半定量积分法［4］判定表达强度：每个切片随机选不重复的5 个视野计算阳性细胞数，每个视野计数100 个腺瘤细胞，分别对每张切片的阳性细胞数及显色程度进行分级记分，最终由两类积分乘值判定表达强度。

3 统计学方法

数据采用SPSS20.0 软件进行分析。计数资料采用卡方检验，计量资料采用单因素方差分析，等级资料采用独立样本秩和检验。

4 结 果

4.1 P53、bFGF、PTEN 在试验组和正常组表达强度比较 试验组中P53、bFGF 表达强度均明显高于正常组（P＜0.05），PTEN 表达强度则低于正常组（P＜0.05），见表1。

表1 P53、bFGF、PTEN 在试验组和正常组表达强度比较

4.2 P53、bFGF、PTEN 在不同IN 程度组表达强度比较 P53、bFGF 在HGIN 组中表达强度明显高于LGIN 组（P＜0.05），PTEN 在HGIN 组中表达强度明显低于LGIN 组（P＜0.05），见表2。

表2 P53、bFGF、PTEN 在不同IN 程度组表达强度比较

5 讨 论

腺瘤是结直肠癌癌前病变，通过对腺瘤早发现、早治疗来防治肠癌已成为业内共识［5］。 癌变过程并非一蹴而成，如何能提前发现，及时阻断或延缓腺瘤癌变的发生发展，这对肠癌的防治具有重要意义。 目前，虽无统一的腺瘤辨证分型，但大多医家认为其病因是在先天不足的基础上伴随后天的脾胃损伤，脾虚不运，痰湿内蕴大肠，日久化热，发为肠瘤［6-7］。 可见，湿热证是腺瘤临床较为常见的证候类型［8-10］。

P53 是一种抑癌基因，但突变形成的突变型P53会诱发肿瘤的生成［11-12］。 bFGF 能通过促进细胞有丝分裂加速肿瘤生长，且通过诱导血管增殖来加速肿瘤转移［13］。 PTEN 则是一种通过调控细胞周期来影响癌细胞增殖、凋亡的抑癌基因［14］。

本研究结果显示：P53、bFGF 在试验组中的表达强度明显高于正常组，而PTEN 的表达强度则明显低于正常组；且试验组中P53、bFGF 在HGIN 组中表达较LGIN 组升高，PTEN 在HGIN 组中表达较LGIN 组下降。 可见，从正常黏膜到管状腺瘤，从LGIN到HGIN 的瘤变过程中，存在着P53、bFGF 表达上调及PTEN 表达下调的现象，进一步证实三者表达失衡对管状腺瘤的瘤变进展起到一定作用。 结合课题组前期研究发现，在大肠管状腺瘤中P53 的高表达可能与湿热证有关，湿热证是一个应引起重视的证型［15］。 本研究同样显示，湿热证管状腺瘤中P53 呈现高表达，提示其机体抑癌保护机制受损可能更为明显。 因本试验的局限性，未能对各中医证型与各蛋白表达强度的关联进行深入分析，有待未来进一步完善相关研究。