DJ-1的高表达通过cyclin D1/p53-MDM2-AKT途径促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭

南昌大学第二附属医院胃肠外科，江西 南昌 330006

结直肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤之一，也是全世界范围内癌症相关死亡的第4大主要原因［1］。目前，手术和辅助治疗是治疗结直肠癌的主要方法。尽管在治疗顺利的情况下，结直肠癌的预后并不乐观，其5年总体生存率不足50%［2］。侵袭转移是其高死亡率和不良预后的主要原因之一，约90%的结直肠癌相关死亡是由于转移性疾病而发生的［3］。前期研究已经进行了大量结直肠癌发生、发展的分子生物学研究，并且发现了许多与转移有关的癌基因和抑癌因子（p53、KRAS及Snail）［4-6］。然而，结直肠癌发生、发展的生物学机制仍有待进一步研究。

DJ-1基因是起初由日本学者Nagakubo等［7］在小鼠的NIH3T3细胞研究中发现并命名的一种新丝裂原依赖性癌基因，该基因位于人类1号染色体短臂36位点（1p36.12-1p36.33），其编码产物DJ-1蛋白是一种高度保守的蛋白、以同源二聚体的形式广泛表达于机体各组织细胞，并参与细胞内多种生理、病理活动，如转录调控［8］、抗氧化应激［9］、抗细胞凋亡［9］、分子伴侣及促细胞生长增殖等［10-11］。早期对DJ-1的研究主要集中在帕金森综合征方面，表明DJ-1基因突变与人类常染色体隐性早发型帕金森病息息相关。然而，自从DJ-1被发现能协同c-MYC或H-Ras等癌基因促进正常永生化成纤维细胞转化后，DJ-1与肿瘤的关系引起了学者的广泛关注。研究表明，DJ-1在胃癌［12］、肝癌［13］、胰腺癌［14］和食管癌［15］等多种消化系统恶性肿瘤中呈现异常高表达，并与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。但是，目前关于DJ-1在结直肠癌中的临床价值、功能及其分子机制的研究仍然很少。因此，探索DJ-1在是否参与结直肠癌的发生、发展对于结直肠癌的防治具有重要的科学意义与临床价值。本研究的完成将为结直肠癌侵袭转移的防治提供新思路和有效的干预环节。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 标本

34例结直肠癌组织、配对的癌旁组织样本来自南昌大学第二附属医院病理科的组织样本库（2016年7月—2018年12月），其中男性24例，女性10例。癌旁组织距离癌灶边缘＞5 cm，且均来自同一结直肠癌患者。

1.1.2 细胞系

人结直肠癌SW480、HCT116细胞系购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.3 主要试剂

DMEM细胞培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，RNA提取试剂TRIzol等购自美国Invitrogen公司，实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）试剂、试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，蛋白质印迹法（Western blot）所用试剂及IP裂解液、BCA试剂盒、BeyoClick™ EdU-555细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。OE-DJ-1过表达稳定转染细胞系SW480、HCT116由上海聚焦生物科技有限公司构建，shDJ-1干扰片段由吉玛基因股份有限公司（中国）构建完成。DJ-1、p53、Bax、Bcl-2、GAPDH、β-tubulin一抗购自美国CST、Abcam公司；cyclin D1、MDM2、p-MDM2、AKT与p-AKT一抗购自美国Proteintech、CST公司，HRP标记山羊抗兔、抗鼠二抗均购自美国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学检测

组织样本芯片经枸橼酸钠修复液（pH为6.0）进行抗原修复（高压修复，5 min），抗DJ-1抗体（浓度1∶800）4 ℃温育过夜，二抗室温温育30 min，DAB显色液反应2 min。自来水冲洗，苏木精复染0.1%HCL分化，二甲苯透明，中性树胶封固切片显微镜观察。

1.2.2 RTFQ-PCR检测

采用TRIzol试剂从34对结直肠癌组织样品中提取总RNA，依据RTFQ-PCR试剂、试剂盒说明书通过RTFQ-PCR合成cDNA，分别用DJ-1和GAPDH进行RTFQ-PCR检测（表1）。RTFQ-PCR扩增条件如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequence

1.2.3 EDU检测细胞增殖能力

分别将Mock组及OE-DJ-1组SW480、HCT116细胞接种于6孔板培养皿中，细胞培养至细胞密度为75%～85%，每孔加入37 ℃预热的100 μL 10 μmol/L EdU工作液温育2 h，EdU标记完成后4%多聚甲醛室温固定15 min，50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液脱色5 min，0.3%Triton X-100的PBS温育10 min，分步Apollo、Hoechst染色反应液染色，激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照记录（Hoechst 33342为蓝光）。

1.2.4 平板克隆实验

取对数生长期的各组细胞，消化重悬后将细胞悬液作梯度倍数稀释，以每孔50、100、200个细胞的梯度密度分别接种于6孔板中，置37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养10～14 d。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5 mL固定15 min。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30 min，在显微镜计数大于10个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率。

1.2.5 划痕实验

先用无菌记号笔于6孔板背面划3条平行直线后备用。将SW480、HCT116细胞接种于准备好的6孔板中，密度约为5×105个/mL。第2天用10 μL的吸嘴垂直于6孔板背面的横线划痕，并用PBS洗去被划下的细胞，记录0、24和48 h各组细胞划痕宽度，计算细胞的划痕面积、伤口愈合百分比。

1.2.6 Transwell侵袭、迁移实验

先将Matrigel基质胶对transwell小室进行预包被处理，即将Matrigel基质胶置于4 ℃预冷后，加入适量Matrigel基质胶覆盖transwell小室底部，将transwell小室放于培养箱中待Matrigel基质胶凝固后取出备用。将消化、重悬后的SW480、HCT116细胞（Mock/OE-DJ-1组、Vector/shDJ-1组）以2×105个/mL的密度每孔100 μL接种于无血清小室上层，下室中加入含20%FBS培养基。温育24 h，用无菌棉签擦去表面未迁移细胞，结晶紫（0.1%）对迁移细胞染色，显微镜下观察计数（迁移实验不加Matrigel基质胶）。

1.2.7 Western blot实验

培养、处理各组细胞后，用Western blot及IP裂解液提取细胞总蛋白（1∶99加入PMSF），并用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度后调平。每组分别取30 μg蛋白用12%丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳分离，采用260 mA电流湿转，转膜后的PVDF膜（0.45 μm）用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，2 h后加入适宜浓度的一抗（DJ-1为1∶1 000，p53为1∶1 000，Bax为1∶500等）于4 ℃温育过夜。第2天取出PVDF膜，TBST洗去膜上未结合一抗（每次10 min，洗3次），加入二抗37 ℃温育1 h后，TBST洗去膜上未结合二抗（每次10 min，洗3次），滴加ECL化学发光显色液进行曝光显影。

1.3 统计学处理

所有实验结果均用统计学软件SPSS 19.0进行分析，采用t检验、Pearsonχ2检验分析DJ-1表达与临床病理学特征之间的相关性，实验结果以表示，P＜0.05为差异有统计学意义。所有实验至少重复2次。

2 结果

2.1 DJ-1在结直肠癌组织中高表达

Western blot检测结果显示，在结直肠癌组织中DJ-1蛋白水平显著高于癌旁组织（表2，图1，P＜0.001）。进一步分析发现，DJ-1高表达与结直肠癌TNM分期、部位、淋巴结转移及分化程度均显著相关（P＜0.01），提示DJ-1高表达可能影响结直肠癌患者的预后（表3）。

表2 DJ-1在结直肠癌组织与癌旁组织的表达水平Tab.2 DJ-1 expression in colorectal cancer and paracancerous tissues

图1 DJ-1在结直肠癌组织中高表达Fig.1 DJ-1 is upregulated in colorectal cancer tissues

表3 DJ-1表达与结直肠癌组织临床病理学特征的相关性Tab.3 The correlation of DJ-1 expression and clinical pathological characteristics of colorectal cancer

2.2 DJ-1过表达（overexpression-DJ-1，OEDJ-1）可促进结直肠癌细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

各组细胞培养14 d，结果显示，DJ-1可促使结直肠癌细胞发生EMT，进而促进转移，其具体分子机制有待进一步研究（图2）。

2.3 DJ-1在体外促进结直肠癌细胞的增殖

图2 细胞EMT研究Fig.2 EMT of the cells

平板克隆形成实验，相比于vector组，SW480、HCT116细胞转染shRNA后（shDJ-1-1#和shDJ-1-2#），单个细胞形成集落的能力显著减弱（图3A，P＜0.01）。同样，EdU增殖实验结果表明，实验组SW480和HCT116细胞EdU阳性率分别为44.9%和47.6%，明显高于阴性对照组的19.3%和24.1%，提示DJ-1过表达可显著促进结直肠癌细胞的增殖（图3B、C，P＜0.05）。

2.4 DJ-1影响细胞周期

SW480、HCT116经shDJ-1有效干扰片段转染成功后，实验组（shDJ-1）相比对照组（Vector），细胞多数停留在G1期，S期细胞减少，且差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。

2.5 DJ-1可促进结直肠癌细胞侵袭、迁移

划痕实验中，相比于对照组（mock），实验组（OE-DJ-1）显著增强了结直肠癌细胞的愈合能力（P＜0.05，图5A、B）。在transwell侵袭迁移实验中，干扰片段（shDJ-1-1#；shDJ-1-2#）有效转染后，实验组细胞侵袭、迁移数显著减少（P＜0.001，图5C、D）。

2.6 DJ-1在结直肠癌细胞增殖、侵袭与转移中的分子机制研究

Western blot、RTFQ-PCR实验结果显示，DJ-1可通过cyclin D1/p53-MDM2-AKT信号通路调控结直肠癌细胞的增殖、侵袭与转移（图6）。

图3 DJ-1在体外促进结直肠癌细胞的增殖Fig.3 DJ-1 promotes proliferation and invasion of colorectal cancer cells in vitro

图4 流式细胞周期实验检测shDJ-1干扰片段对结直肠癌细胞周期的影响Fig.4 Flow cytometry was used to detect the effect of shDJ-1 interference fragment on colorectal cancer cell cycle

图5 DJ-1可促进结直肠癌细胞的侵袭、迁移Fig.5 DJ-1 promoted invasion and migration of colorectal cancer cells

图6 DJ-1通过cyclin D1/p53-MDM2-AKT信号通路调控结直肠癌细胞的增殖、侵袭与转移Fig.6 DJ-1 regulates proliferation,invasion and metastasis of colorectal cancer cells via cyclin D1/p53-MDM2-AKT signaling pathway

3 讨 论

结直肠癌是一种常见的癌症，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。近年来，尽管结直肠癌的综合治疗措施不断发展完善，但是其总体预后不容乐观，5年生存率仍不足50%［1］。主要原因是晚期肿瘤侵袭、转移的发生，一旦发生预后极差。因此，深入探索结直肠癌侵袭、转移发生的分子机制，确立结直肠癌侵袭转移防治靶点，寻求新的干预策略对临床上防治结直肠癌侵袭转移、提高晚期结直肠癌患者的临床疗效具有特殊的重要性和迫切性。

本研究发现，DJ-1在结直肠癌组织中高表达（蛋白水平及mRNA表达），且其表达与结直肠癌TNM分期、部位、淋巴结转移及分化程度相关，提示DJ-1有望作为判断结直肠癌预后的分子标志物。深入研究发现，DJ-1体外实验可增强结直肠癌细胞的生长和转移。这些结果表明，DJ-1有助于结直肠癌的发生、发展，但其具体的分子机制仍有待进一步的深入研究。

肿瘤细胞恶性增殖、迁移和侵入基底膜进入周围组织、血液和淋巴管的能力是癌症的基本标志之一，也是局部肿瘤进展、转移扩散的先决条件［16］。为了深入研究DJ-1与结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移之间的关系及其分子机制，本研究通过Western blot预实验发现DJ-1可负性调控p53。p53作为一种经典抑癌基因，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现p53突变［17］。由p53编码的蛋白质是一种转录因子，其控制着细胞周期的启动，进而通过复杂分子网络调控细胞增殖、细胞凋亡［18-19］。随着近10年研究的深入，p53作为抑癌基因的功能逐渐被揭示出来。p53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，它与细胞内其他信号转导通路间的联系十分复杂，已知p53参与调控的基因逾160种［20］。本研究发现，DJ-1与p53基因存在相互作用关系，进一步深入研究发现，p53作为上游分子并不能调控DJ-1的表达，但是我们发现在结直肠癌细胞SW480、HCT116中DJ-1可调控p53的表达，在OE-DJ-1、shDJ-1中均得到了验证，其分子调控机制可能是通过DJ-1-p53-MDM2-AKT信号通路调控结直肠癌细胞的增殖、侵袭迁移。本研究发现，p53并不直接调控MDM2、AKT的表达，而是影响p-MDM2、p-AKT的磷酸化，其具体的分子机制有待进一步研究。另外，本研究还发现，DJ-1调控结直肠癌细胞增殖可能与cyclin D1相互作用有关。Cyclin D1，即G1/S-特异性cyclin D1，由人类CCND1基因编码，其主要功能是促进细胞增殖［21］。目前，cyclin D1基因已被公认为是一种原癌基因，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。本研究发现，DJ-1可影响cyclin D1蛋白的表达，且其调控关系为正向调控，DJ-1通过正向调控cyclin D1，影响凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达，从而促进结直肠癌细胞的恶性增殖。

综上所述，本研究发现，DJ-1在结直肠癌中高表达，且与临床病理学特征息息相关。因此，DJ-1有望作为分子标志物用于判断结直肠癌预后。针对DJ-1-cyclin D1/p53-MDM2-AKT信号途径的靶向作用将为结直肠癌侵袭转移的防治提供新思路。