人肝癌裸鼠皮下移植瘤早期血液供应模式的定量研究

曹 蓉 李若坤 强金伟 李 瀛 刘巧遇 王 杰

（1复旦大学附属金山医院放射科 上海 201508；2上海交通大学医学院附属瑞金医院放射科 上海 200025）

肝癌是全球常见的恶性肿瘤，最新的全球癌症统计中肝癌的死亡率高居第四位，占全球癌症死亡总数的8.2%，是全球男性癌症患者死亡的第二大原因［1］。在肝癌血管生成过程中，显微镜下可以观察到的肝癌微血管异常主要为动脉生成及肝窦毛细血管化［2］。当前肝癌血管生成过程中新生血管的形成机制仍不明确。经典的肿瘤血管生成理论认为：肿瘤生长首先经历无血管期，当瘤体增大时，单纯依赖弥散供氧已无法满足其生长，肿瘤细胞释放多种血管生成因子和基质蛋白，募集并引导新生的血管内皮细胞发育为有功能的毛细血管袢，与宿主血管相互吻合，随后新生的血管内皮细胞长入肿瘤中，为肿瘤细胞的快速生长提供营养［3］。1999年美国学者 Maniotis等［4］在研究高侵袭性人眼葡萄膜黑色素瘤时发现：其内部具有一些与血管相连的PAS染色阳性的管道样结构，并将此定义为血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）。VM中肿瘤细胞与血流之间仅有一层基底膜相隔，肿瘤细胞溶解基底膜后便能直接进入血液循环，使得VM易于发生血道转移。大量研究证实VM与肿瘤血行转移、复发及患者的生存期、预后等密切相关［5-9］。抗肿瘤血管内皮细胞药物索拉菲尼是治疗晚期肝癌的一线药物，然而，单纯针对内皮细胞的抗血管生成治疗对含VM的肝癌疗效不佳，甚至促进了肿瘤的侵袭和转移［10-13］，解释为索拉菲尼虽然抑制了肿瘤血管内皮形成，却因导致肿瘤细胞缺氧，促进了肿瘤VM的形成［11，13］。故含有 VM的肝癌患者并不适用于单纯抗内皮血管治疗，肝癌VM的机制研究及病理诊断对于患者的预后评估及治疗方案的选择具有重要意义。本研究通过对种瘤后不同时间点荷人肝癌裸鼠皮下移植瘤内的微血管进行病理学观察及定量研究，探究肝癌早期血管形成过程中血液供应模式的变化，以期为肝癌抗血管生成药物的研究提供新的思路。

材料和方法

实验细胞株人肝癌高转移性单克隆细胞MHCC97-H（复旦大学肝癌研究所提供），复苏后生长于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2湿度饱和的恒温密闭培养箱内进行培养。选用0.25%胰蛋白酶，3～4天消化传代1次。细胞消化、冻存及复苏等具体方法与其他细胞株相同。

实验动物4周龄雄性SPF级BALB/c-nu小鼠，体重14～16 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK（沪）2017-0005］，饲养于上海市公共卫生实验动物中心SPF级动物房中［SCXK（沪）2015-0001］，饲养期间给予小鼠标准饲料及洁净饮用水（均由上海市公共卫生实验动物中心提供）。房间内维持恒温（22±2）℃，昼夜12 h循环。

实验试剂DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司），进口澳洲胎牛血清（美国HyClone公司），0.1 mol/L PBS缓冲液（江苏凯基生物技术股份有限公司），DMSO（美国Sigma公司），4%多聚甲醛（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），醇溶性伊红染液、苏木精染液（上海江莱生物科技有限公司），盐酸酒精染液（北京九州天瑞科技有限公司），二甲苯（南京化学试剂股份有限公司），无水乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司），0.01mol/L PBS缓冲液（福州迈新生物技术开发有限公司），一抗（CD34）、二抗（EnVision试剂）（丹麦Dako公司），过碘酸-雪夫溶液染色试剂盒（南京森贝生物科技有限公司）。

实验仪器CO2培养箱（上海力康生物医疗科技控股有限公司），恒温水浴锅、烘箱（上海精宏实验设备有限公司），超净实验台（苏州净化设备公司），倒置显微镜、光学显微镜（日本OLYMPUS公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），通用台式低温离心机（美国Beckman Coulter公司），全自动石蜡包埋机、切片机、半自动脱水机（德国Leica公司），切片漂烘温控仪（安徽省电子科学研究所）。

皮下瘤移植小鼠动物房适应1周后进行异位皮下移植操作。0.25%胰蛋白酶消化对数生长期MHCC97-H细胞，吹打成单细胞悬液。0.4%台盼蓝染色活细胞比率大于98%，（233×g）洗涤2次。用无血清的低温DMEM高糖培养液，调整细胞浓度为1×107/mL，以每只裸鼠接种0.2 mL的剂量，于同一时间接种在40只裸鼠左侧腹股沟区皮下。所有实验操作均在超净工作台进行。

病理染色颈髓脱臼法处死成瘤小鼠，眼科剪切开皮肤取出新鲜肿瘤标本，剥离表面结缔组织，生理盐水清洗表面血迹，4%多聚甲醛的固定，石蜡 包 埋 ，4 μm 厚度连 续 切 片 ，行 HE、CD34及CD34/PAS免疫组化染色使用。

观测指标

微血管评判标准 按照Weidner等［14］制定的评判标准，任何CD34阳性（染成棕色）的单个内皮细胞或内皮细胞簇，只要能和临近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就作为1个血管计数。同一个血管的“头”和“尾”正巧在同一切面上，作为2个血管计数；血管内径大于容纳8个红细胞及有肌层的血管不作为微血管计数。

微血管密度计数 在低倍镜下浏览CD34染色切片确定微血管丰富的区域后，在200倍镜下，选择染色清晰、背景对比良好的3个视野拍摄照片，利用病理图文分析软件计数由CD34抗体染成棕色的血管数目，取其平均值来表示微血管密度（microvessel density，MVD）（单位：条/视野）。

微血管面积计数 微血管面积（microvascular area，MVA）选取方法同MVD，选取200倍视野下3个微血管丰富的视野拍摄照片，利用病理图文分析软件自动及手动勾勒出微血管管腔，取其平均值来表示MVA（单位：μm2）。

VM判定标准［15］（1）HE染色肿瘤细胞围成管道样结构，管腔中央有红细胞存在；（2）CD34/PAS双染色示管壁仅有肿瘤细胞组成，无CD34染色阳性内皮细胞；（3）一层PAS染色阳性基底膜样结构将肿瘤细胞与管腔隔开；（4）对于少量管壁由肿瘤细胞和内皮细胞共同参与构成的马赛克血管（mosaic vessel，MV），亦按照VM判定。

VM计数 按照VM的判定标准，先在低倍镜下浏览CD34/PAS双染色切片，选取微血管丰富的区域，在400倍镜下，利用病理图文分析系统结合人工判定计数PAS阳性血管数，取平均值作为VM数量（单位：条/视野）。VM百分比=VM数量/（VM数量+内皮依赖性血管数量）×100%。

统计学方法采用SPSS 23.0统计软件和GraphPad Prism 6软件进行数据处理，实验结果用表示，两组间比较，服从正态分布及方差齐性者，使用t检验，否则采用Wilcoxon秩和检验。多组数据比较，服从正态分布及方差齐性者，使用单因素方差分析，否则采用非参数独立样本检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

细胞形态MHCC97-H在DMEM培养液（含10%胎牛血清）中贴壁生长，情况良好。细胞形态完整，边界清晰、透明，细胞数量较多，连接成片。细胞形态以多角形、多边形为主，少数呈圆形，细胞分泌物较多，细胞间连接紧密。细胞核大，核仁明显且数目较多，约3～5个。部分细胞伸出伪足（图1）。

图1 不同放大倍数下MHCC97-H细胞形态Fig 1 Morphology of MHCC797-H cells at different magnifications

镜下观察（1）第2周染色切片示肿瘤边缘存在粗大的CD34染色阳性棕色内皮血管（图2A～C），肿瘤内部未见明显坏死。（2）第3、4周HE染色切片肿瘤边缘发现VM（图2D），其为内含红细胞的管腔样结构，管壁未见内皮细胞，而是由肿瘤细胞组成。CD34染色阴性（图2E），CD34/PAS双染色示VM管腔样结构管壁为一层PAS染色阳性基底膜样结构（图2F）。（3）第5周HE染色切片中见部分管壁由内皮细胞及肿瘤细胞共同围成，即MV（图2G）。CD34染色示MV管壁部分染色阳性（染成棕色），部分染色阴性（图2H）。CD34/PAS双染色示MV管壁同时存在PAS染色阳性基底膜样结构及棕色阳性血管内皮，管壁及管腔内见肿瘤细胞（图2I）。

图2 人肝癌裸鼠皮下移植瘤中不同血液供应模式的病理学表现Fig 2 Histological characteristics of different blood supply patterns in human hepatocellular carcinoma subcutaneous xenografts in nude mice

定量分析

人肝癌裸鼠皮下移植瘤内微血管参数 第2、3、4、5周肿瘤内MVA（μm2）分别为28 795.5±3 412.7、13 720.8±2 375.6、29 221.3±3 958.5和 19 735.5±1 855.5，其中第 2、3周及第 3、4周比较差异有统计学意义，第3周肿瘤MVA小于第2周（P=0.013），第4周肿瘤MVA大于第3周（P=0.025），MVA呈先下降后升高的趋势（图3）。第2、3、4、5周肿瘤内MVD（条/视野）分别为26.1±2.3、28.7±4.9、53.7±11.0、45.4±6.3，不同时间点肿瘤内MVD差异无统计学意义。

人肝癌裸鼠皮下移植瘤内血管生成拟态参数第 2、3、4、5周肿瘤内 VM（条/视野）数量分别为25.6±19.8、13.6±7.2、18.7±2.5、54.2±43.1，不 同时间点肿瘤内VM数量差异无统计学意义。第2、3、4、5周肿瘤内肿瘤内VM百分比（%）分别为50.1±14.6、64.2±12.9、84.2±15.4、69.5±21.6，不同时间点肿瘤内VM百分比不同，其中第2、4周比较差异有统计学意义，第4周肿瘤VM百分比高于第2周（P=0.015），VM百分比呈升高趋势（图3）。

图3 时间对人肝癌裸鼠皮下移植瘤内微血管参数的影响Fig 3 Effect of time on the vascular parameters of the human hepatocellular carcinoma subcutaneous xenografts in nude mice

讨 论

既往学者们认为血管新生包括血管生成和血管发生两种方式［16-17］，血管生成指宿主既存的血管以芽生的方式形成肿瘤内的新生血管［18］，而血管发生是由受到募集的内皮祖细胞等分化、迁移、增殖，在宿主血管上形成新的血管网络［19］。大量的研究通过阻止肿瘤内血管新生过程，以达到阻断肿瘤血供的目的。目前VM的形成机制仍未明确，研究VM形成机制对于研制VM特异性靶向药物具有重要意义。

本研究于种瘤第3周镜下可见到典型VM结构，管腔内见红细胞，CD34/PAS免疫组化双染色证实管壁为一层PAS染色阳性基底膜样结构，符合病理学家Maniotis对于VM的定义［4］。通过对肿瘤不同时期的微血管进行定量研究，发现肿瘤的MVA值呈现先下降后升高的趋势，第3周的MVA较第2周降低，而实际观察中第3周肿瘤并未因缺乏血液供应而出现明显的坏死，提示了肿瘤生长过程中不仅存在内皮依赖性血管这一种血液供应方式。VM定量计数结果显示肿瘤VM百分比呈明显升高趋势，提示随着肿瘤生长，肿瘤血液供应模式由内皮依赖性血管的弥散作用逐渐转换为由VM提供。我们在镜下也观察到部分肿瘤细胞直接存在于管腔中。因此与内皮依赖性血管结构比较，VM特殊的结构更加有利于肿瘤早期快速生长和增殖。

目前研究报道的肿瘤内血液供应方式有VM、MV和内皮依赖性血管等 3种［6，17］。VM 由肿瘤细胞直接在基底膜样物质的表面形成，管腔内无内皮细胞衬覆。MV由肿瘤细胞和内皮细胞共同衬覆在管道内壁。Zhang等［20］使用活性炭作为示踪剂证明VM、MV与宿主血液循环相通，VM、MV也是肿瘤内的血液供应方式。进一步的定量研究［21］发现，在小鼠皮下接种后第2周时，肿瘤组织内以VM数目最多，而当小鼠皮下接种后第3周时，肿瘤组织内VM数目明显下降，内皮依赖性血管数目明显增多。基于以上实验结果，Zhang等［20］认为黑色素瘤中存在VM、MV和内皮依赖性血管等3种不同的血液供应模式，三者间具有时间延续性关系：肿瘤组织内以VM数目最多，为黑色素瘤生长的主要血液供应形式；随着肿瘤的生长，内皮依赖性血管数目增多，逐渐代替VM，故肿瘤内的血管由VM逐渐过渡为内皮依赖性血管，MV可能为VM和内皮依赖性血管间的过渡形式。与上述研究［21］不同的是，本研究显示，第4周的VM百分比较第2周升高（P=0.015），表明在肿瘤血管生成的最初阶段，肿瘤的血液供应模式并非以VM为主，随着肿瘤生长时间的延长，VM成为肿瘤的主要血液供应模式。Ricci-Vitiani等［22］通过研究发现胶质母细胞瘤中大部分的内皮细胞具有与肿瘤细胞相同的基因组改变（20%～90%，平均60.7%），血管内皮细胞含有肿瘤发生细胞的一个子集，这些细胞在免疫受损小鼠体内产生高度血管化的间变性肿瘤，并具有VM区域。在免疫功能低下的小鼠体内原位或皮下注射胶质母细胞瘤干细胞，可产生肿瘤异种移植物，其血管主要由人内皮细胞构成，提示VM可能代表肿瘤干细胞向内皮细胞分化的不完全过程。

综上所述，在人肝癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成的早期阶段，VM与内皮依赖性血管共存，随着肿瘤生长时间的延长，VM逐渐成为肿瘤的主要血液供应模式。本研究显示了肝癌血管生成过程中血液供应模式的复杂性，提示针对内皮血管或VM的单一靶向治疗药物不能完全抑制肝癌的血供形成。