Ⅰ群禽腺病毒检测方法的研究进展

刘吉山，孙培姣，于 雪，苗立中，柳增善，尹梅芳，沈志强，，肖跃强*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；3.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春130062；4.滨州市滨城区梁才兽医站，山东 滨州 256658)

Ⅰ群禽腺病毒(group Ⅰ fowl aviadenovirus,FAdV)是给家禽养殖业带来诸多问题的病原体群，其病原复杂，感染率高，常与其他引起禽类呼吸道疾病的病原体混合感染，造成严重的经济损失。该群病毒血清型众多，且血清型之间或同一血清型不同毒株的致病性不同，在临床上的确诊难度比较大。因此，早发现、早确诊对控制该病毒的防控有重要作用。

FAdV传统的诊断方法仅限于病毒分离，然后用血清学方法检测，如免疫荧光分析、中和试验或血细胞凝集抑制试验等，随着生物技术的发展，分子生物学检测手段越来越多的应用到病原体检测。

1 病毒的分离

分离鉴定是一种经典的病毒诊断方法，准确性和可靠性高，但其检测周期较长。由于腺病毒的形态特性，用电子显微镜比较容易诊断，因此电子显微镜在禽腺病毒诊断中有重要作用。在感染禽腺病毒的肝脏中，用负染法染色后，用电子显微镜下可以观察到二十面体的病毒颗粒。此外，用透射电子显微镜也观察到了体积大致相等球形粒子[1]。然而，没有纯化的病毒，只根据形态学的特征不能进行分群或鉴别其血清型，且该方法不适用于临床大规模检测。

在FAdV感染的早期，可采集病变肝脏、肾脏及粪便等病毒含量高的组织及排泄物样品，用腺病毒阴性鸡胚分离病毒。首先选用被感染的病料组织器官，制成悬液，经过卵黄囊接种5～7日龄鸡胚，于接种后2～10 d可见鸡胚死亡和发育停滞，胚体出血，肝脏有坏死灶，肝细胞中有核内包涵体。王婉等[2]将临床疑似鸡包涵体肝炎病例的肝组织接种无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡胚，分离得到1株鸡包涵体肝炎病毒，病理学观察见肝组织出现典型病变，并伴有脂肪变性。通过卵黄囊和绒毛尿囊膜将鸡腺病毒接种到鸭胚中，死亡的鸭胚中均伴有胚胎萎缩和病理性出血，且在胚胎的肝脏中观察到了核内包涵体。

也可用鸡胚、鸡胚及鸡细胞等进行分离培养[3-4]，一般用鸡胚肝、鸡胚肾细胞来分离，用荧光抗体进行细胞染色检查，确定 FAdVs 的感染。另外一种非特异的方法是对可以的细胞培养物用苏木精-伊红染色，观察有无核内包涵体[5]。有学者用鸡胚肾细胞进行分离和培养了该病毒，细胞出现退化、脱落等病变，并且有嗜碱性核内包涵体。AFZAL等[6]用QT 35 细胞和Vero细胞对引起HPS的腺病毒进行培养，结果病毒不能增殖，也未观察到任何细胞病变，ROY等[7]在Vero细胞上盲传4代，在接种96 h后观察到了典型的细胞病变。

由于FAdV感染后所呈现的临床症状与病毒血清型之间没有明确的相关性，因此一般先从临床表现、血清流行病学初步调查，并通常通过观察组织病变和肝细胞的病理学切片进行初诊[8]，后进行实验室确诊及病毒相关特性及分型的研究[9]。

除病毒分离外，实验室常用的禽腺病毒检测方法还有琼脂扩散试验(AGP)、间接血凝试验、鸡胚病毒中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、环介导等温核酸扩增技术(LAMP)等血清学和分子生物学方法。

2 血清学方法

2.1 血清中和试验中和试验是根据抗体能否中和病毒，使其失去感染性而建立的免疫学试验。既可固定病毒滴度等量倍比稀释血清，也可固定血清用量，与等量系列对数稀释的病毒混合。鸡感染FAdV后2～3 d可产生中和抗体，病毒中和试验特异性和敏感性较强，可用于病原鉴定、确定血清型、检测血清中抗体等[10]，但对检测人员要求较高，费用高，耗时长。

2.2 琼脂凝胶扩散试验琼脂扩散试验(agar gel diffusion precipitation,AGP)为可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的半固体凝胶(琼脂或琼脂糖)中进行的一种沉淀试验，结果判定时以是否观察到清晰白色的抗原抗体结合形成的沉淀为标准，出现则为阳性，反之则为阴性。该法不仅可以检测抗原，也可用来检测抗体，在兽医临床上有广泛应用。该试验常用于鉴别抗原血清型、评价血清抗体阳性率以及抗体滴度，适用于对感染鸡群进行抗体检查。

张中秋等[11]将FAdV-1 型 OTE毒株经尿囊腔途径接种鸡胚，以收获的尿囊液作为AGP反应抗原来检测抗体，取得了满意结果。智海东等[12]研制的禽腺病毒琼脂扩散抗原可与1∶8以上稀释的FAdV阳性血清反应，最早可以在 8～12 h 出现沉淀线，且不与其他主要禽类病原体阳性血清反应。对 3 月龄 SPF 鸡进行人工感染腺病毒，第 7 天可检测到沉淀抗体，血清中的沉淀抗体可持续 3 个月以上，该抗体可用于病毒感染的血清学检测。此方法简单、易操作，但耗费时间比较长，且对抗原要求浓度高、纯度高，一般要将病毒进行纯化浓缩处理，敏感性相对较差，且存在漏检的可能。

2.3 ELISA检测方法间接酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用于检测简便、快速、特异性强和灵敏度高，各种改进ELISA 常被用于检测FAdV群特异性抗体和型特异抗体。由于标记酶酶促反应的放大作用，其灵敏度比常规血清学检测要灵敏的多，尤其适合大批量的血清学调查。

ELISA用于FAdV的检测已有不少研究。SAIFUDDIN 等[13]建立的检测组织及血液中 FAdV 群特异性抗原的ELISA检测方法，能检测出感染肝脏中小于 100 TCID50/mL的病毒。随后SAIFUDDIN等[14]建立的ELISA检测方法可以检测FAdV的12种血清型。

CALNECK等[15]以10 个不同血清型的毒株作为包被抗原，与血清进行交叉反应后结合，建立了检测鸡腺病毒抗体的ELISA方法。刘延珂等[16]以纯化的 FAdV-4 中国流行株作为包被抗原，建立了一种快速检测 FAdV-4 血清抗体的间接 ELISA 方法，与抗减蛋综合征病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒阳性血清均无交叉反应；批内和批间最大变异系数小于5%；对40份来自疑似 FAdV-4 感染病鸡的血清样品进行检测，结果与PCR 检测结果符合率为100%。

Hexon蛋白是FAdV的主要结构蛋白，含有主要的群和亚群特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，与致病性密切相关，作为诊断抗原具有良好的应用前景[17]。Hexon蛋白是中和抗体的靶目标和主要保护性抗原，能刺激机体产生中和抗体，抑制病毒体构象的改变，从而中和病毒。由于不同血清型病毒的Hexon基因高度保守，因此可用Hexon重组蛋白做抗原检测抗体水平。

文艳玲[18]和谢芝勋等[19]以纯化好的Hexon蛋白作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，然后用对12种血清型腺病毒免疫的SPF鸡血清进行检测，结果对1、4、5、8、9型的敏感性为100%，6、10、11型的敏感性为90%，对2、3、12型的敏感性为70%；与琼脂扩散试验相比，敏感性高20%。

在健康和感染FAdV的禽体内都存在抗体的情况下，血清学检测方法存在难以区分的问题。但邓显文等[20]以原核表达、纯化后病毒非结构重组蛋白33K重组蛋白为包被抗原，通过筛选和优化间接ELISA的条件，建立了间接33K-ELISA抗体检测方法，能成功鉴别病毒野毒感染与灭活疫苗接种。XIE等[21]用ELISA方法在人工感染FAdV的鸡体内检测到病毒非结构蛋白100K和33K的特异性抗体，而在用灭活疫苗免疫的鸡体内未发现，他们发现可以用NSP的抗体区分疫苗免疫和野毒感染。

2.4 间接免疫荧光试验免疫荧光技术(immunofluorescence technique ，IFA)始创于40 年代初，是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。国纪垒[22]通过自制FAdV 12 个血清型参考毒株的兔抗 FAdV IgG，经过条件优化建立了FAdV间接免疫荧光检测方法，并检测了FAdV侵害的主要靶器官，试验证明，该方法快速、敏感、特异性高。

3 分子生物学方法

六邻体蛋白(Hexon)是FAdV的主要结构蛋白之一，带有主要的属和亚属特异性抗原决定族，与保护性免疫反应有关，现已有不少根据Hexon基因建立的分子生物学检测方法。

3.1 PCR法检测近些年发展起来的聚合酶链式反应(PCR)检测方法已成功应用于多种病毒的基因检测和分子流行病学调查。随着分子生物学的发展，可以在疾病的早期检测感染禽类体内的病毒，这样可以更早地确诊。自2015年以来，在北京、山东、河南等地发生的以心包积水、包涵体肝炎、肾炎、呼吸道症状等为特征的传染病，给我国的养禽业造成了严重经济损失。经诊断多数为禽腺病毒FAdV-4感染，因此对FAdV进行分离鉴定及快速准确的检测具有非常重要的意义。FAdV是DNA病毒，利用 PCR 方法可以快速、敏感的进行诊断，通常取病禽的肝脏或心包积水，提取基因组后进行 PCR。

由于不同血清型病毒的Hexon基因高度保守，因此根据Hexon基因设计建立的PCR诊断技术具有很高的敏感性和特异性。GANESH 等[23]从感染腺病毒的肝脏组织或全病毒中提取DNA，然后用特异性引物进行PCR，成功扩增出700 bp大小的Hexon片段，该片段随后被用于斑点杂交法检测病毒DNA的探针。THAKOR等[24]针对Hexon基因设计的特异性引物扩增产物890 bp，可以检测野毒引起的禽腺病毒感染。何秀苗等[25]利用PCR方法，通过扩增其基因组的2个末端L片段、R片段、ITR片段，成功地对1株疑似FAdV的分离物(FAVI-JS)进行了鉴定。

同时，其中一些研究者将PCR技术与限制性内切酶分析技术相结合，即利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术对FAdV进行分型及多态性分析。RAUE等[26]和HESS等[27]根据Hexon基因设计引物，扩增出1 319 bp的片段， 然后用HpaⅡ 酶对PCR产物消化，进行鉴定和多态性分析。MASE等[28]的研究发现，用AluⅠ酶酶切短纤维基因可以用来区分各FAdV-4毒株。2009年，国内唐熠等[29]根据编码 FAdV 壳粒蛋白的Hexon基因序列设计合成两对引物，能够特异地扩增出 12 个血清型的 FAdV，结合运用HpaⅡ限制性内切酶对 PCR 扩增产物酶切，能鉴定I群的12个血清型。

PCR方法从基因水平检测病毒，特异性强，敏感度高，在发病早期就可以检测到病原体，并且基本不需对样品进行纯化、培养、传代等处理，极大地提高了该病的诊断速度。

3.2 Real-time PCR检测法Real-time PCR技术实现了从常规 PCR定性到定量的跨越。与常规 PCR 相比，Real-time PCR 敏感性高、特异性强而且快速、高效、操作简单等优点，被广泛用于生物医学研究及临床诊断。

Real-time PCR技术所用的化学制剂包括能结合双链DNA的荧光染料(如SYBR Green I)和荧光基团标记的探针(如Taq Man探针)2种。荧光标记探针法敏感性好，特异性高，检测结果准确，但需要设计探针，成本相对较高。而特异性荧光染料可以和所有 DNA 双链进行结合，价格便宜，不需要对探针进行设计，但荧光染料可与体系中的特异、非特异扩增产物均能结合，导致试验结果出现假阳性，因此对引物的特异性和反应体系的质量要求很高。

目前，已经有不少用Real-time PCR检测FAdV的报道。赵雪丽等[30]建立了检测FAdV-4的TaqMan MGB荧光定量PCR方法，最低检出限1×101copies/μL，且与其混合感染或感染症状相似的其它病原体无交叉反应。文艳玲等[31]根据Ⅰ群禽腺病毒六邻体基因的保守序列设计的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法可检测I亚群腺病毒的12个血清型。方法的敏感性同朱余军等[32]的液相基因芯片检测技术相同。

唐熠等[33]建立并比较了Real-time PCR、PCR、半巢式PCR、LAMP等4种核酸检测方法的敏感性，结果发现在对阳性重组质粒的检测结果中，Real-time PCR敏感度最高，其次是半巢式PCR、LAMP，普通PCR敏感性最低。对不同病毒滴度(TCID50和ELD50)进行检测，结果相同。

朱余军等[32]根据Hexon基因的保守区设计特异引物，建立的检测的液相基因芯片检测技术特异性强，12 个血清型均为阳性，与ARV、IBV、EDSV、IBDV、MDV等均无交叉反应；敏感度高，可达1×102copies/μL；检测结果稳定，批内、批间变异系数都在 5% 以下，与 SYBR Green I 荧光定量 PCR方法检测结果 100% 相符。

3.3 探针检测法核酸探针技术是根据碱基互补配对原理，通过标记的核酸探针与互补靶基因片段进行杂交，以检测样本中的目的基因片段，具有特异性与敏感性强、快速准确等特点，现已在临床疾病诊断和治疗、基因多样性的种性检测及病原体的检测等方面被应用。根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为人工合成的寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针、RNA探针等几类，目前针对病毒探针杂交检测技术已经比较成熟。

核酸探针按标记物可分为放射性和非放射性标记2大类。放射性同位素标记探针检测灵敏度高，可到pg级；定位定量准确，方法简便，但由于半衰期限制，标记后存放的时间有限，易造成放射性污染，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。目前，生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin)是应用较多的非放射性标记物。

国外关于通过原位杂交技术直接检测组织样品中的FAdV DNA的方法已有报道。这些研究中使用的探针是根据FAdV-10五邻体基质的核酸序列和FAdV-1的相关DNA而设计[34-35]。

王凤龙等[36]根据Hexon基因特点，用限制性内切酶HindⅢ和EcolⅠ 双酶切得到636 bp的基因片段，然后用地高辛标记制备DNA 探针，通过原位杂交技术直接检测组织样品中的病毒DNA，其灵敏度为 0.1～0.3 mg/L。董婷婷等[37]用地高辛标记，利用PCR的方法制备了FAdV-1、2、4、8及12血清型病毒的核酸探针，各血清型之间及与其他亚群之间无交叉反应，最低检测量为1 pg。崔杨[38]根据各个血清型Hexon基因特异性区域的特点，扩增到特异性的目的片段并以地高辛进行标记，成功获得7个血清型病毒的特异的探针，经过检测探针的各型之间不存在交叉反应，探针的灵敏度均在5 pg。

3.4 环介导等温核酸扩增技术环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，于2000年由日本学者NOTOMI等[39]发明，在恒定温度条件下开展核酸扩增的新技术，具有快速、特异、敏感、操作简易等优点。另外，其反应产物可以不通过检测仪器直接观察结果，在基层条件较差的地方也能够开展相应的检测工作，因此受到较大的关注。2010年，唐熠等[40]根据 FAdV Hexon 蛋白基因保守区序列设计引物，建立了一种LAMP 快速检测方法，敏感性可达1×101copies/μL，比PCR法略高；白元斌[41]针对FAdV-4设计的LAMP检测方法，在检测了临床发病鸡的 21 份肝脏样品后，也得到了相同的结果。

目前，随着研究者对检测方法的改进，以及不断出现新的检测技术与方法，大大提升了检测准确性与敏感性，必将为该病的防控起到积极重要的作用。

4 小结

FAdV在世界范围内普遍感染，血清型众多，且不同血清型的致病性有较大差异，对病原认识不清，做不到有针对性的防制，是该病不断蔓延、暴发的重要原因。目前，疫苗接种和注射卵黄抗体是有效防治FAdV感染所致疫病的重要手段，但病毒各血清型交叉保护性有限，必须选用与流行株匹配的疫苗和卵黄抗体才能有效，且我国目前还没有商品化的疫苗。

近些年，禽腺病毒诊断方面取得的进展主要是在分子水平上，较之分离病毒等传统方法，分子生物学方法在检测混合感染上更具优势，PCR检测技术已经应用到临床上禽腺病毒的检测。然而，由于禽类腺病毒的多样性和禽类宿主的范围广泛性，仍有许多问题未得到解决。迄今为止，还没有可以检测12种血清型的PCR检测方法，然而，随着高致病性FAdV毒株的出现，这种通用的可以检测不同血清型的方法显得的尤为重要，由于禽腺病毒可垂直传播，及时快速查清病原，淘汰病禽，对禽腺病毒的临床诊断和有效防治有非常重要的意义。

除此之外，提高饲养管理水平，做好日常消毒工作，对防止病毒的扩散和传播有一定作用。