miR-3685 通过靶向CTTN 抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭及生长

2020-04-21 06:29闫晓芳
天津医科大学学报 2020年1期
关键词:细胞周期质粒进程

闫晓芳,谢 虹,汤 华

(天津医科大学基础医学院病原生物学系,天津市生命科学中心实验室,天津市炎症生物学重点实验室,天津300070)

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,在全世界可以导致死亡的癌症中排名第四位[1]。研究表明,每年有超过50 万名女性被诊断患有宫颈癌,每年因患有宫颈癌而死亡的人数超过30 万[2]。所以研究用于宫颈癌早期诊断或预后的新型生物标志物对于女性健康是必须的。miRNA 是短链单链非编码RNA,参与各种生理和病理过程[3]。大量研究表明miRNA 在包括癌症在内的多种疾病中发挥着不同的作用[4-5],它们可能以一种致癌基因的身份去参与调节细胞的增殖能力、凋亡速率、侵袭性及转移[6]。例如,miR-148a 作为肿瘤抑制基因通过直接靶定Wnt1 mRNA 的3′UTR 抑制肺癌细胞的迁移和侵袭[7],miR-221-3p 可以通过靶向THBS2 来治疗癌症[8],本实验室报道了一种新的miRNA(miR-G-1)通过靶向TMED5 促进宫颈癌细胞的恶性行为和核自噬[9]。但是,目前miR-3685 对宫颈癌细胞的功能研究知之甚少,作用机制也尚不清楚。CTTN 基因位于人染色体11q13,有研究证明其能够促进食管癌细胞系的运动、侵袭以及抗失巢凋亡能力[10]。比起正常组织,在26%的乳腺癌组织中可以观察到CTTN 含量增多,并且CTTN 的过表达可以促进多种癌细胞的运动性和侵袭性[11-12],但是CTTN 对宫颈癌细胞的功能作用尚不清楚。所以,本文旨在探讨miR-3685 和CTTN 对宫颈癌细胞恶性行为的影响,从而为宫颈癌提供新的治疗思路。

综上所述,本实验结果首次证明了miR-3685通过抑制宫颈癌细胞迁移、侵袭和生长来抑制其恶性行为,本研究强调了miR-3685-CTTN 轴在宫颈癌发病机制中的重要性,该调控轴可以为预防宫颈癌的发生提供潜在的价值和治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料 宫颈癌HeLa和SiHa细胞(美国ATCC公司),RPMI1640 液体培养基、DMEM 液体培养基(美国GIBCO 公司),细胞上皮标志物E-cadherin抗体、细胞间质标志物vimentin 抗体、EGFP 抗体、偶联HRP 的山羊抗兔抗体(天津赛尔生物公司),细胞培养箱(美国Thermo Fisher 公司),胎牛血清(FBS;美国Hyclon 公司),LipofectamineTM 2000 regent(美国Invitrogen 公司),Matrigel、流式细胞仪(美国BD Biosciences 公司),RNase A(100U;德国Calbiochem 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养人宫颈癌细胞系 HeLa 和SiHa 细胞在含有8%或10%胎牛血清、100 μg/mL 链霉素和100 IU/mL 青霉素的RPMI-1640 或DMEM 培养基中培养,将细胞孵育在37 ℃,5%CO2的培养箱中,2~3 d 更换1 次新鲜培养液,待细胞汇合度达到80%~90%时进行传代培养。

1.2.2 细胞转染 提前1 d 接种指数生长的HeLa细胞和SiHa 细胞于24 孔细胞培养板,使细胞汇合度在培养14~18 h 时达到70%~80%。配制A 转染液:在100 μL 液体培养基(Opti-MEMα)中加入1 μg 实验组质粒或者对照组质粒,吹吸混匀。配制B转染液:把1 μL Lipofectamine 2000 Reagent 脂质体加在100 μL 液体Opti-MEMα 中混匀,5 min 后,将A、B 液混合,20 min 后,将混合液加入到24 孔细胞培养板,4~6 h 弃掉培养板中的液体,每孔加入1 mL含血清的液体培养基,在培养箱中继续孵育。

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 使用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa,大连,中国)进行RTqPCR 以检测miRNA 和mRNA 的表达水平。小RNA特异性茎环逆转录引物用于进行miRNA 的逆转录。U6 snRNA 和β-肌动蛋白分别用作miRNA和mRNA的内源对照。

1.2.4 迁移/侵袭实验 根据制造商的说明书,使用不含或含Matrigel 的transwell 小室进行迁移/侵袭测定。转染后24 h,用1×PBS 洗涤细胞,重悬于无血清培养基中并接种到上室(6×104细胞用于迁移,8×104细胞用于侵袭)。下室加入600 μL 含有20%FBS的HeLa 细胞或SiHa 细胞的培养基。温育48 或72 h,将迁移/侵袭的细胞用75%甲醇-25%冰醋酸固定并用结晶紫染色。在显微镜下放大100 倍对5 个随机选择的视野进行成像,并在Nikon TE2000 显微镜下对迁移/侵袭的细胞计数。

1.2.5 集落形成实验 在转染后24 h,将HeLa 和SiHa 细胞以500 个cell/孔的密度接种到12 孔板中。每3 d 更换1 次新鲜培养基,持续两周。用结晶紫染色,然后计算菌落形成率。

1.2.6 细胞周期实验 转染后24 h,用PBS 洗涤细胞3 次并用胰蛋白酶消化,然后用95%的乙醇固定过夜。PBS 洗涤细胞,并在PBS/0.05%Triton X-100 混合液中重悬,将细胞与不含DNA 酶的RNase A 在室温下共温育30 min,并用25 mg/mL 的碘化丙锭染色。室温、黑暗中静置30 min,然后用流式细胞仪检测细胞周期变化。

1.2.7 Western blot 通过蛋白质印迹实验检测蛋白质的表达水平。转染48 h 后,收集细胞,用RIPA裂解液在4 ℃条件下裂解30 min。在10%SDS-PAGE凝胶中分离等量的细胞裂解物,并转移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%脱脂乳(TBST 稀释)在室温下封闭2 h,加入一抗4 ℃孵育过夜,随后,将膜与辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗在室温下孵育2 h。通过增强的化学发光液检测蛋白质表达,通过Image J 量化条带强度。

1.3 统计学处理 所有统计分析均由Graphpad Prism 7.0 进行。使用配对Student’st检验评估对照组和实验组之间的显著性差异。P<0.05 被认为具有统计学意义。数据显示为来自至少3 次独立实验的x±s。

2 结果

2.1 miR-3685 抑制宫颈癌细胞的迁移/侵袭及生长构建 miR-3685 过表达质粒(pcDNA3/miR-3865)并商业合成其封闭剂(ASO-miR-3685),用RT-qPCR实验检测其有效性,结果表明质粒均有效(图1A)。Transwell 迁移/侵袭实验结果表明:过表达miR-3685可显著抑制HeLa 和SiHa 细胞的迁移/侵袭能力,而封闭miR-3685 可促进HeLa 和SiHa 细胞的迁移/侵袭能力(迁移:图1B,侵袭:图1C)。Western blot 实验(图1D)、克隆形成实验(图1E)及细胞周期实验(HeLa:图1F,SiHa:图1G)结果表明:过表达miR-3685能抑制HeLa 和SiHa 细胞的EMT 进程、集落形成能力及细胞周期进程,而封闭miR-3685 却得到相反的结果。

图1 miR-3685 对HeLa 和SiHa 细胞的迁移/侵袭能力、EMT 进程、集落形成能力及细胞周期进程的影响Fig 1 Effect of miR-3685 on migration/invasiveness,EMT progression,colony forming ability and cell cycle progression of HeLa andSiHacells

RT-qPCR 实验检测miR-3685 的过表达质粒及其封闭剂ASO-miR-3685 在HeLa 和SiHa 细胞中是否有效(A);Transwell 实验检测过表达或封闭miR-3685 对宫颈癌细胞迁移(B)/侵袭(C)能力的影响;Western blot 实验验证过表达或封闭miR-3685对宫颈癌细胞EMT 进程的影响(D);克隆形成实验检测miR-3685 对宫颈癌细胞集落形成能力的影响(E);流式细胞术检测miR-3685 对HeLa(F)和SiHa(G)细胞的细胞周期进程的影响(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

2.2 CTTN 是miR-3685 的直接作用靶基因 为了进一步研究miR-3685 的潜在机制,使用miRBase 2.1 和TargetScan7.1 预测miR-3685 的潜在靶点,根据预测得分情况挑选了以下4 种候选靶基因,即CTTN,PRKAR2B,ULK2,RERE。在HeLa 细胞中将miR-3685 结合CTTN, PRKAR2B, ULK2,RERE 的3′UTR(WT)序列分别克隆到pcDNA3-EGFP 报告系统中,并在HeLa 细胞中与pcDNA3/miR-3685 共转染,用Western blot 实验评估这4 种候选靶基因的EGFP 蛋白表达水平。结果发现,相比其他3 种候选靶基因,用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 与pcDNA3/miR-3685 共转时,EGFP 的蛋白表达水平降低的最明显(图2A),于是笔者初步选择CTTN 作为miR-3685 的靶基因进行后续的验靶实验。在HeLa 细胞中将miR-3685 结合CTTN 的3′UTR(WT)或(mut)序列克隆到pcDNA3-EGFP 报告系统中,并在HeLa 细胞中与pcDNA3/miR-3685 或ASOmiR-3685 分别共转染。进行Western blot 分析以评估CTTN 的EGFP 蛋白表达水平。miR-3685 与CTTN 野生型及其突变型之间的结合位点如图2B所示。用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 与pcDNA3/miR-3685 共转时,Western blot 实验显示EGFP 蛋白水平明显降低,用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR与ASO-miR-3685 共转时, Western blot 实验显示EGFP 蛋白水平有所升高(图2C), 用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR-mut 与pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共转时, Western blot 实验显示EGFP 蛋白水平没有明显变化(图2D)。笔者进一步测量了CTTN 的mRNA 表达水平和内源性蛋白表达水平,结果发现,过表达miR-3685 后,CTTN 的mRNA 表达水平和内源性蛋白表达水平明显降低,而过表达ASO-miR-3685 后,CTTN 的mRNA 表达水平和内源性蛋白表达水平明显升高(图2E,F)。这些数据证明CTTN 是miR-3685 的直接靶标,并且它的表达受miR-3685 的负调节。

图2 在HeLa 细胞中验证CTTN 是miR-3685 的直接靶标Fig 2 Verify that CTTN is a direct target of miR-3685 in HeLa cells

用Western blot 实验验证4 种候选靶基因(CTTN, PRKAR2B, ULK2,RERE)的EGFP 蛋白表达水平的变化(A);miR-3685 与CTTN 野生型及突变型之间的结合位点(B);pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 与pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共转,用Western blot 实验验证EGFP 蛋白水平的变化(C);pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR-mut 与pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共转,用Western blot实验验证EGFP 蛋白水平的变化(D);在HeLa 细胞中转染pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 质粒,用RT-qPCR 和Western blot 实验检测CTTN 的mRNA(E)和内源性蛋白表达水平(F)变化(**P<0.01,***P<0.001,ns:无显著性差异)。

2.3 CTTN 对宫颈癌细胞迁移/侵袭、EMT 进程、集落形成能力及细胞周期进程的影响 CTTN 的过表达和敲降质粒用于研究它们在宫颈癌细胞中的作用。通过RT-qPCR(图3A)和Western blot(图3B)实验检测其是否有效,结果表明质粒均有效。Transwell 迁移/侵袭实验结果表明:过表达CTTN 促进了HeLa 和SiHa 细胞的迁移/侵袭能力,而敲降CTTN 抑制了HeLa 和SiHa 细胞的迁移/侵袭能力(迁移:图3C,侵袭:图3D)。Western blot 实验(图3E)、克隆形成实验(图3F)及细胞周期实验(HeLa:图3G,SiHa: 图3H) 结果表明:过表达CTTN 可促进HeLa 和SiHa 细胞的EMT 进程、集落形成能力及细胞周期进程,敲降CTTN,得到相反的结果。

图3 CTTN 对宫颈癌细胞迁移/侵袭、EMT 进程、集落形成能力及细胞周期进程的影响Fig 3 Effects of CTTN on migration/invasion, EMT progression,colony formingability and cell cycle progression of cervical cancer cells

RT-qPCR 实验(A)和Western blot 实验(B)检测CTTN 的过表达质粒及其敲降质粒在HeLa 细胞中是否有效;过表达或敲降CTTN 对宫颈癌细胞迁移(C)/侵袭(D)能力的影响;Western blot 实验验证过表达或敲降CTTN 对宫颈癌细胞EMT 进程的影响(E);克隆形成实验检测CTTN 对宫颈癌细胞集落形成能力的影响(F);流式细胞术检测CTTN 对HeLa(G)和SiHa(H)细胞的周期进程的影响(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

3 讨论

miRNA 在组织和细胞中通常都是异常表达的,这表明它们在临床应用中可作为诊断、治疗或预后的生物标志物[13]。比如,在肝癌中低表达的miR-193a-5p 与其患者的生存期缩短有关[14],在结直肠癌细胞中,miR-25-3p 可促进结直肠细胞的血管通透性和血管生成,表明其具有潜在的癌症进展价值[15]。miR-21siRNA 干扰载体可以抑制宫颈癌Hela 细胞中miR-21 基因的表达,促进细胞凋亡,延缓细胞周期进程[16]。本研究内容揭示了miR-3685 可以抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭、EMT 进程、细胞增殖以及细胞周期进程。这些结果为miR-3685 的功能作用提供了新的见解。

最近,有研究报道称,在结肠癌细胞中,CTTN 可以通过invadopodia 形成而募集FMNL2 来加速肌动蛋白聚合和内体运动[17],还有报道表明在结直肠癌中CTTN 可以通过激活EGFR-MAPK 途径来促进细胞的增殖[18]。同时,一些特异性miRNA 也可以调节CTTN 的表达,例如,miR-182 可以通过调节CTTN的表达从而抑制肺癌的转移、侵袭和增殖能力[19],miR-542-3p 通过抑制cortactin 的表达抑制结直肠癌细胞的生长和侵袭[20]。在本研究内容中,揭示了CTTN 可以促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力及生长。还揭示了miR-3685 对CTTN 的负性调控作用。

总之,本实验结果首次证明了在宫颈癌中miR-3685 可以通过抑制CTTN 的表达而发挥抑癌作用。本研究强调了miR-3685-CTTN 轴在宫颈癌发病机制中的重要性。miR-3685 负调控CTTN 的表达可以为宫颈癌的治疗及预防提供新的参考方向。

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