桑枝低聚糖促乳酸菌生长活性优化研究

杨诗沅,邹宇晓,胡腾根,李 倩,黎尔纳,*,廖森泰,*

(1.华南农业大学 食品学院， 广东 广州 510642； 2.广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室， 广东 广州 510610)

桑枝是桑的细长枝条，是蚕桑资源中生物量占有比例最高的物质。多糖是桑枝的主要活性物质，由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸等组成[1-2]。桑枝多糖主要由1,6-β-D-Galp、1,3,6-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp组成骨架以及1,2-α-L-Araf、1,3,6-β-D-Galp、1,4-β-D-Xylp残基组成分支[3]。

肥胖、糖尿病和心血管疾病等与人体肠道菌群失衡有关[4]，补充益生菌是预防和治疗这些疾病的有效措施，补充含有益生菌的食品及益生菌制品是外源补充益生菌的主要方法[5]。低聚糖比多糖具有更高的益生活性，低聚糖类益生元的研究开发是益生菌活菌补充剂等微生态保健品的发展方向。张梅红[6]采用戊聚糖酶及盐酸制备不同分子量阿拉伯木聚糖，发现所制备的阿拉伯木聚糖均能促进双歧杆菌增殖，表现为降解程度越高，益生活性越好。Wang等[7]通过体外培养的方法发现，菜籽多糖及其酶解片段能显著促进青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌等益生菌的增殖，但菜籽多糖酶解片段的增殖效果更好。

国内外关于桑枝多糖的研究主要集中在其结构测定及降血糖、抗肿瘤、抗氧化等活性方面，桑枝多糖在食品领域的研究主要是桑枝多糖粉在医疗保健品及食品饮料上的利用，而对桑枝低聚糖类微生态食品的研究甚少。本研究采用物理超声、化学酸解和生物酶解法制备桑枝低聚糖，考察桑枝低聚糖对乳酸菌增殖的效果，并对酶法制备的低聚糖工艺进行优化，希望为桑枝低聚糖益生元在功能性食品中的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

桑枝多糖(桑枝提取1-脱氧野尻霉素后醇沉获得的粗多糖，经检测后其多糖质量分数约为75%)，北京五和博澳药业有限公司提供；MRS肉汤，广东环凯微生物科技有限公司；β-甘露聚糖酶(50 U/mg)，广州市齐云生物技术有限公司；硫酸、氢氧化钠(分析纯)，广州化学试剂厂；植物乳杆菌(LactobacillusplantarumGIM1.191)、肠膜明串珠菌(LeuconostocmesenteroidesGIM1.774)、干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiGIM1.411)、鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGIM1.325)，购于广东省微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 主要仪器设备

THZ- D型台式恒温振荡器，江苏省太仓市华美生化仪器厂；HWS26型电热恒温水浴锅、DHP- 9082型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW- CJ- 2FD型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1乳酸菌菌液的制备

取-80 ℃保存的菌种接种于MRS液体培养基中，37 ℃、180 r/min震荡培养过夜。

1.3.2活菌总数及增殖率的测定

乳酸菌活菌总数的测定：菌落计数法，参考GB 4789.35—2016中乳酸菌菌落总数测定方法。将空白对照组(阴性)活菌总数设置为100%，乳酸菌增殖率计算方法见式(1)。

(1)

1.3.3不同水解方式对桑枝低聚糖促乳酸菌生长的测定

1.3.3.1 桑枝低聚糖的制备

1)物理超声水解制备桑枝低聚糖。根据Yu等[8]超声降解紫菜多糖的方法，并稍做修改。将多糖溶液在25 ℃、500 W下超声处理20 min，灭酶后4 ℃储存备用。

2)化学酸水解制备桑枝低聚糖。根据和法涛等[9]的猴头菇酸水解工艺，并适当调整。将多糖溶液按体积比为1∶1加入3 mol/L硫酸溶液，混合后于80 ℃下水浴酸水解3 h，水解结束后加入6 mol/L氢氧化钠溶液中和，灭酶后4 ℃储存备用。

3)生物酶解制备桑枝低聚糖。根据缪月秋等[10]对葫芦巴中性杂多糖酶解工艺，添加50 mg·mL-1的β-甘露聚糖酶于多糖溶液中，50 ℃酶解4 h，灭酶后4 ℃储存备用。

1.3.3.2 3种方式制备的桑枝低聚糖促乳酸菌生长的测定

分别添加经3种方式制备的桑枝低聚糖、桑枝多糖和对照组商品化益生元(低聚异麦芽糖、低聚半乳糖)到MRS液体培养基，使质量浓度达到3.00 mg·mL-1。向培养基中接种1%过夜培养的乳酸菌菌液，37 ℃、180 r/min震荡培养过夜，按1.3.2中方法计算乳酸菌增殖率。

1.3.4桑枝低聚糖浓度促鼠李糖乳杆菌生长的测定

将经生物酶解法制备的桑枝低聚糖，添加到MRS液体培养基中，使终质量浓度分别达到24.00、12.00、6.00、3.00、1.50、0.75 mg·mL-1。向培养基中接种1%过夜培养的鼠李糖乳杆菌菌液，37 ℃、180 r/min震荡培养过夜，按1.3.2中方法计算增殖率。

1.3.5桑枝低聚糖酶法制备条件的优化

以鼠李糖乳杆菌增殖率为指标，选择不同β-甘露聚糖酶添加量、酶解温度、酶解时间，研究其对桑枝低聚糖酶解条件的影响。实验参数见表1。

表1 酶解条件及参数

1.3.6响应面法对桑枝低聚糖生物酶解条件的优化

综合单因素实验结果，采用Box-Behnken响应面设计法对酶解条件在三因素三水平上进行工艺参数的优化。实验因素与水平设计见表2。

表2 响应面试验设计因素与水平

1.4 数据分析

试验数据均为3次重复平均值。采用SPSS和Excel进行数据统计处理。

2 结果与讨论

2.1 不同水解方式对桑枝低聚糖促乳酸菌生长的影响

不同水解方式制备的低聚糖对4株乳酸菌增殖活性影响，实验结果见表3。由表3可知，经生物酶解处理的低聚糖对4株乳酸菌的促生长作用明显，与桑枝多糖及商品化益生元(低聚异麦芽糖、低聚半乳糖)比较，均存在显著性差异(P<0.05)，并且对鼠李糖乳杆菌的增殖率最高(311.42%±0.13%)。本研究表明，生物酶解处理的低聚糖对4株乳酸菌都具有良好的增殖作用。

表3 不同水解方式制备的桑枝低聚糖对4株乳酸菌增殖率的影响

数据表示为3次重复的“平均值±标准偏差”；根据Duncan的多范围检验，同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 桑枝低聚糖浓度对鼠李糖乳杆菌增殖率的影响

图1 桑枝低聚糖浓度对鼠李糖乳杆菌增殖率的影响Fig.1 Effect of different concentration of Ramulus mori oligosaccharide on proliferation rate of Lactobacillus rhamnosus

低聚糖浓度对鼠李糖乳杆菌益生活性的影响，实验结果见图1。由图1可知，低聚糖质量终浓度在0.75～6.00 mg·mL-1时，鼠李糖乳杆菌增殖率随其质量浓度增大而提高，并且在低聚糖质量浓度为6.00 mg·mL-1时达到最大(356.67%±0.35%)，但质量浓度进一步增大时，增殖率反而降低。这种情况可能是桑枝低聚糖浓度过高，溶液渗透压增大，乳酸菌细胞脱水，且糖液黏度大，不利于菌落生长繁殖。蒋艾廷等[11]通过增加培养基中碳源的质量浓度，发现酿酒酵母的生长呈先增大后减小的趋势，推测可能是由于碳源浓度过高导致培养基渗透压过高，不利于酵母生长，进一步说明作为乳酸菌体外增殖的益生元需要适宜的浓度。

2.3 酶法制备桑枝低聚糖条件的优化结果分析

2.3.1酶法制备的桑枝低聚糖对鼠李糖乳杆菌增殖率影响

图2 酶解条件对酶法制备的桑枝低聚糖促鼠李糖乳杆菌增殖率的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on proliferation rate of Lactobacillus rhamnosus promoted by enzymatic preparation of Ramulus mori oligosaccharides

酶法制备的桑枝低聚糖对鼠李糖乳杆菌增殖率影响见图2。β-甘露聚糖酶添加量在10.00～90.00 mg·mL-1时制备的低聚糖，对鼠李糖乳杆菌的增殖率呈先增后减的趋势(图2(a))。当酶添加量为50.00 mg·mL-1时，增殖率达到最高值(369.33%±0.08%)；当酶添加量大于50.00 mg·mL-1时，增殖率反而降低。这种情况可能是因为多糖的活性与其分子质量存在相互作用，只有一定分子质量范围内的多糖才具有较高活性[12]，过多的酶使多糖在短时间内水解更彻底，被打断成更小的片段，过度降解制备的低聚糖益生活性较低。

酶的活性与温度有关，且存在最适反应温度。大部分β-甘露聚糖酶最适温度在40～65 ℃，低于或高于最适温度，酶不稳定，活性降低甚至丧失[13-14]。不同酶解温度制备桑枝低聚糖，对鼠李糖乳杆菌增殖率的影响结果见图2(b)。β-甘露聚糖酶添加量50.00 mg·mL-1、酶解时间4 h，酶解温度50 ℃时，桑枝低聚糖对鼠李糖乳杆菌增殖效果最好，此时增殖率为383.33%±0.23%。

不同酶解时间制备的桑枝低聚糖，对鼠李糖乳杆菌增殖率的影响，实验结果见图2(c)。酶解时间为2～6 h，增殖率呈先快速增加后缓慢降低趋势，并在4 h时达到最高值367.00%±0.11%。这一现象可能是，随时间的延长，多糖降解量增加，糖链断裂，产生更多的活性低聚糖；经过4 h酶解形成的低聚糖更利于鼠李糖乳杆菌的生长，但水解时间进一步延长使水解产物的组成发生改变，益生活性降低。从益生活性和成本考虑，认为4 h的酶解时间较好。因此选择β-甘露聚糖酶添加量50.00 mg·mL-1、酶解时间4 h，酶解温度50 ℃，进行响应面实验。

2.3.2响应面试验结果分析

在单因素实验的基础上，选定β-甘露聚糖酶添加量、酶解温度、酶解时间进行三因素三水平的Box-Behnken试验，结果见表4，二元多次回归方程见式(2)。

增殖率=367.60-8.62×A-34.13×
B+15.75×C-24.50×A×B-56.25×
A×C+22.75×B×C-100.05×A2-
41.55×B2-69.80×C2。

(2)

响应面模型的P值<0.000 1，说明模型高度显著，可信度高；模型的R2=0.991 4，校正R2=0.980 4，说明该模型可以很好地模拟和验证实验结果；变异系数为4.27%，置信度较高，说明模型可以反映真实的实验值[15-16]，因此可以选择该模型来分析桑枝多糖促益生活性的变化。

各因素交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖率的影响响应曲面分析结果见图3。经响应面优化的酶解条件理论值为：酶添加量49.80 mg·mL-1、酶解温度46.07 ℃、酶解时间 4.05 h，增殖率预测值为374.76%；为简化工艺，将条件调整为酶添加量50.00 mg·mL-1、酶解温度46 ℃、酶解时间4 h，经实验验证得到实际增殖率为396.30%±0.42%，与预测值相符。

表4 Box-Behnken试验设计及结果

图3 各因素交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖率的影响Fig.3 Effects of interactive factors on proliferation rate of Lactobacillus rhamnosus

3 结 论

本研究采用物理超声、化学酸解和生物酶法制备桑枝低聚糖，探讨了低聚糖对植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌增殖率的影响；发现酶法制备的低聚糖能特异性地增殖鼠李糖乳杆菌。在各单因素实验的基础上，采用Box-Bohnken响应面设计法，以鼠李糖乳杆菌增殖率为指标，对低聚糖的酶解工艺进行了优化。实验结果显示，酶法制备低聚糖的优化工艺：β-甘露聚糖酶添加量50.00 mg·mL-1、酶解温度46 ℃、酶解时间4 h，此时鼠李糖乳杆菌的增殖率为396.30%±0.42%，是桑枝多糖增殖率(144.98%±0.12%)的2.7倍，并且增殖效果优于商品化益生元低聚异麦芽糖(158.13%±0.10%)和低聚半乳糖(186.16%±0.12%)。本研究优化了桑枝低聚糖的制备工艺，如果将其作为益生元添加于乳酸菌饮料或乳酸菌高密度培养体系中，对提高发酵效率、节约时间成本，将带来较好的效果。