高效液相色谱法测定大豆维生素E方法的优化

赵 霞 ，曹改萍，王 敏，岳爱琴，张永坡，高春艳，牛景萍 ，赵晋忠 ，杜维俊

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西省农业种子总站，山西太原030000；3.山西农业大学文理学院，山西太谷030801）

维生素E又称生育酚，分子式为C29H50O2，是透明淡黄色黏稠油状物。天然维生素E含有8种异构体，因其取代基的数量和位置不同，一般分为生育酚和三烯生育酚2类，分别为α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和α-三烯生育酚、β-三烯生育酚、γ-三烯生育酚、δ-三烯生育酚，在外界环境下不稳定，容易受光、氧气等影响被氧化破坏，所以，准确测定分析生育酚较为困难。

样品前处理是分析检测的前提条件，前处理由于工作量大、耗时长，很大程度上决定了整个分析检测的优劣[1-4]。近年来，食品中天然维生素E提取方法发展迅速，主要方法有皂化法[5-8]、溶剂提取法[9]、加压溶剂提取法[10-11]、超临界流体萃取法[12-13]、超声波萃取法、固相萃取法[14-15]等，其中，超声波萃取法的优势在于能促进并加速维生素E的提取过程，而且可避免高温对维生素E组分的破坏，特别是对固体样品前处理更有利。

大豆等双子叶植物中只含有4种生育酚，由于β-生育酚含量极低，且不易与γ-生育酚分离，因此，一般把（γ＋β）-生育酚含量算作γ-生育酚含量。目前，测定维生素E的方法主要有比色法[16]、紫外分光光度法[17]、红外光谱法[18]、荧光法[19]、气相色谱法[20]、液相色谱法[21-22]等。每种方法各有其优缺点。目前采用最多的是高效液相色谱法（HPLC），它具有灵敏度高、分离效果显著、重复性好等优点[23]。

维生素E是人体维持多种生理活动不可替代，又不能自身合成，必须从外界摄取的营养元素，是一种天然的抗氧化剂。天然维生素E主要存在于以大豆为代表的油料作物中。随着人们对身体健康、生活质量的关注程度不断提高，对天然维生素E的研究将成为当今时代的一个热门课题和大豆未来研究的重要方向。目前，国内外关于维生素E对人体健康的作用报道较多，但植物样品中天然维生素E检测方法的文献不多，而天然维生素E各组分结构复杂，异构体种类多，因此，急需找到一种简单、高效、准确的测定方法。

本研究在查阅国内外文献基础上，采用目前最先进的方法，对大豆维生素E提取方法及测定方法进行优化，旨在为大豆育种种质资源筛选和培育富含维生素E大豆新品种提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试大豆品种为武乡小黑豆，由山西农业大学遗传与种质创新实验室提供。

1.2 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪，型号为1260，购于美国Agilent公司；震动球磨仪，型号为GT200，购于北京格瑞德曼公司；真空冷冻干燥机，型号为ATS.D5-2M，购于北京科仪公司；超声波清洗器，型号为KM-300DE，购于昆山美美超声仪器有限公司；平行浓缩仪，型号为MultiVap-8，购于美国LabTech公司；旋涡混合器，型号为QL-901 Vortex，购于江苏其林贝尔公司。

α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚标准品，每种纯度均≥98%，购于美国Solarbio公司；甲醇，为HPLC级，购于美国Tedia公司；抗坏血酸、乙醇、正己烷，为分析纯，购于康为世纪生物科技有限公司。

1.3 大豆维生素E提取方法的优化

将大豆籽粒置于-20℃冰箱中24 h，再放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，之后将样品使用球磨仪磨成粉密封保存备用。

1.3.1 大豆维生素E提取的单因素试验 试验方法在参考李海燕[24]的方法上进行优化。具体步骤为：（1）准确称取大豆粉 0.100 0 g；（2）分别加入 0、0.025、0.050、0.075、0.100 g 抗坏血酸；（3）分别加入3 mL 50%、60%、70%、80%、90%乙醇；（4）振荡混匀10 s后，超声提取 5、10、15、20、25 min；（5）加入 6 mL正己烷；（6）振荡混匀 20 s后，超声萃取 15 min；（7）取出后12 000 r/min离心8 min；（8）取上清液使用平行浓缩仪用N2将上清液吹干，复溶于1 mL甲醇中备用。

1.3.2 大豆维生素E提取的正交试验 本试验以抗坏血酸的量、提取时间、提取液乙醇浓度作为正交设计的3个因素，每个因素设置4个水平，正交试验设计（L16（43））如表1所示。采用HPLC法测定大豆维生素E含量，3次重复。

1.4 液相色谱检测方法的优化

参考GB/T 5009.82—2016 食品维生素E中测定维生素E的方法，对测定维生素E的各个高效液相色谱条件进行优化。

1.4.1 最佳流动相 分别在流动相为甲醇、甲醇∶水＝98∶2（体积比）、甲醇∶水＝96∶4（体积比），柱温35℃，流速1 mL/min，波长294 nm条件下，经HPLC测定各对应峰面积。

1.4.2 最佳温度 分别设定柱温为25、30、35、40℃，流动相为甲醇，流速1 mL/min，波长294 nm条件下，经HPLC测定各自对应峰面积。

1.4.3 最佳流速 分别在流速为0.8、1.0、1.2mL/min，流动相为甲醇，柱温35℃，波长294 nm条件下，经HPLC测定各对应峰面积。

表1 HPLC法测定维生素E正交试验设计

1.4.4 最佳检测波长 分别设置波长为290、294、295、300 nm，流动相为甲醇，柱温35℃，流速1 mL/min条件下，经HPLC测定各对应峰面积。

1.5 标准曲线的确定

利用高效液相色谱法测定不同大豆品种各生育酚峰面积，经计算大致确定山西当地大豆品种各生育酚的浓度范围。配制5个浓度梯度（囊括所得浓度范围）的δ-生育酚、γ-生育酚、α-生育酚，测得峰面积，以浓度（X，μg/mL）对峰面积（Y）作图，用Excel软件进行回归拟合，即得到α-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚的标准曲线方程。各生育酚浓度梯度如表2所示。

表2 各生育酚浓度梯度 μg/mL

1.6 维生素E质量的计算

根据各生育酚标准曲线确定回归方程，计算得到待测溶液中各生育酚的浓度（c），进一步计算得到样品中各生育酚的质量（Xi）。

其中，Xi为样品中大豆维生素E的含量（μg/g）；c为样品中各生育酚浓度（μg/mL）；V为样品总体积（mL）；m为样品质量，样品为脱水大豆粉（g）。

1.7 回收率及精密度的确定

将α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚标准品分别稀释到同一个低浓度下经HPLC测定其峰面积，重复6次。

取维生素E混合标准品溶液，按照色谱条件进行测定，连续进样6次，每次进样量为20 μL，记录各生育酚单体峰面积，并计算各单体含量及相对标准偏差[25]。

相对标准偏差（RSD）＝标准偏差（SD）/计算结果的算术平均值（X）×100% （2）

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 单因素试验 为了得到维生素E组分最佳提取条件，以抗坏血酸的加入量、提取液乙醇浓度、超声波萃取时间为考虑因素，维生素E组分含量为评价指标，经单因素试验分析，确定适合大豆维生素E组分提取的最佳条件。从图1可以看出，其他条件不变情况下，加入抗坏血酸的量对提取维生素E的影响不大，当加入0.100 g抗坏血酸时，3种生育酚对应峰面积相对较大。

从图2可以看出，在其他条件不变情况下，分别用50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇提取维生素E，3种生育酚对应峰面积整体呈现出先上升后下降的趋势，于70%浓度乙醇提取下效果较佳。

从图3可以看出，在其他条件不变情况下，超声提取时间对3种生育酚含量波动不大，超声提取20 min时，3种生育酚对应峰面积相对较大。

2.1.2 正交试验 由图4可知，处理15条件下，α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的峰面积均达到最大值，分别为10.2、104.0、57.9。说明该条件下各生育酚提取效率最高，因此，选择加入0.125 g抗坏血酸、70%乙醇提取液、超声提取20 min为最佳提取条件。

2.2 液相色谱检测条件的优化

2.2.1 不同流动相比例对测定维生素E含量的影响 从图5可以看出，不同流动相条件下各生育酚的峰形均呈现较好的分离状态，且峰形尖锐。当流动相为纯甲醇时，各生育酚出峰时间明显提前于甲醇与水的混合流动相，综合考虑成本、效率等因素，本试验选择纯甲醇为定量分析大豆维生素E的流动相。

2.2.2 不同流速对测定维生素E含量的影响 从图6可以看出，试验比较了0.8、1.0、1.2 mL/min这3个流速下维生素E色谱峰的峰形及分离情况，综合考虑分离度、峰形、出峰时间，最终确定流速为1.0 mL/min时，峰形及分离效果最佳，且基线稳定性较好，所以，本试验选择的流速为1.0 mL/min。

2.2.3 不同色谱柱温度对测定维生素E含量的影响 从图7可以看出，柱温对各生育酚的峰面积及峰形影响不大，35℃时分离效果最好，且基线稳定性较好，所以，本试验选择色谱柱温35℃。

2.2.4 不同检测波长对测定维生素E含量的影响

根据文献报道，维生素 E 在 290、294、295、300nm[26-28]处有最大吸收，本试验同时对同一样品在4个波长下进行检测。由图8可知，维生素E在295 nm处的吸收强于其他波长的吸收，因此，本试验所选的检测波长为295 nm。

2.3 各生育酚回归方程和检出限的分析

配制维生素E组分的一系列混合标准溶液，在确定的最佳色谱条件下进行分析。以3种生育酚浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，得到维生素E各组分的线性方程、决定系数及检测限，结果如表3所示。

从表3可以看出，用该方法检测的α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的线性方程的决定系数R2均大于 0.999 7，检出限分别为 0.15、0.03、0.03 μg/g，呈现良好的线性关系。

表3 生育酚HPLC测定时浓度（X）与峰面积（Y）的关系

2.4 回收率和精密度分析

将α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚标准品分别稀释到一个低浓度下经HPLC测定其峰面积，重复6次。经计算得出，回收率的范围为96.9%～101.2%，相对标准偏差均小于2，可用于维生素E各组分的定量分析（表4）。

表4 回收率和精密度测定结果

3 结论与讨论

目前，高效液相色谱法广泛用于定量分析不同样品中的微量物质，如花青素[29-30]、荧光增白剂[31]、皂苷[32]等。有研究表明，长期服用维生素E可以增强人体的免疫功能，对细胞增殖有一定的作用[33]。因此，本试验采用高效液相色谱法来测定大豆维生素E含量。

试验结果表明，提取维生素E主要取决于提取液的浓度，加入的抗坏血酸的量和提取时间对提取维生素E的影响不大。最终确定的方法与李海燕[24]的方法相近，称取0.100 0 g大豆粉，加入0.125 g抗坏血酸，70%乙醇提取液，超声提取20min。虽然C18色谱柱是键合型的，填料很难被洗下来，但是萃取液正己烷是非极性溶剂，即使进样量只有20 μL，若样品量大，长期下来还是会对柱效产生较大影响，又因维生素E易氧化，因此，本试验借鉴LU等[34]使用N2将正己烷吹干后复溶于洗脱液甲醇经HPLC测定。

本研究结果表明，最终确定的HPLC测定方法：流动相为甲醇，柱温35℃，检测波长295 nm，流速1.0 mL/min，这与柳树海等[27]的方法基本一致，维生素E各组分标准曲线的R2值均大于0.999 7，维生素E各组分的回收率在96.9%～101.2%，测定结果的重现性和精密度良好，可以准确定量维生素E的含量，这与王丽等[35]研究生育酚异构体回收率的结果一致，因此，该方法可用于测定大豆籽粒中各生育酚含量。