饮水添加螺旋藻和益生菌对小鼠生长、免疫及粪中菌群的影响

金娉婷，张伶燕，赵红波，刘 雪，盛清凯,3*，王迎雪

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点试验室，山东济南 250100；2.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081；3.山东师范大学生命科学院，山东济南 250014；4.山东大学第二医院，山东济南 250033）

螺旋藻（Spirulina，SPI）为一种光能自养型微生物，含有丰富的多糖、维生素等营养成分，另含有蓝藻蛋白、螺旋藻多糖等多种生理功能物质，作为一种功能食品被广泛食用。最近几年，人们开始用污水培养螺旋藻[1]，其生产成本不断降低，螺旋藻作为一种饲料原料或饲料添加剂开始被广泛关注。

螺旋藻作为水产饲料可以促进鱼、虾的生长及免疫[2]，但其促进生长和免疫的机理不清楚。枯草芽孢杆菌、乳酸菌等作为调节肠道菌群、促进生长免疫的绿色饲料益生菌制剂（Probiotics，PRO）常用于猪饲料中，但螺旋藻与益生菌两者之间是否协同尚不清楚。前期研究表明，饲料中添加0.5%螺旋藻可以促进口蹄疫疫苗免疫仔猪的生长，与益生菌配伍协同可提高免疫蛋白IgM含量[3]，推测螺旋藻促进生长、免疫的机理可能与疫苗免疫[4]或黏膜免疫[5]有关。对于正常非免疫动物而言，螺旋藻及与益生菌联用对生长、免疫的影响尚不清楚。动物肠道及肝脏上含有芳香烃受体（Aryl Hydrocarbon Receptor，AHR）、Toll 样受体（Toll-Like Receptor，TLR）等多种与免疫、炎症有关的受体，营养物质常通过AHR 等受体信号通路发挥促进生长、免疫的作用[6]，但螺旋藻及益生菌对AHR 等受体的影响未见报道。研究螺旋藻对AHR 等的影响有助于明确益生菌的作用途径。本试验旨在研究螺旋藻及其与益生菌联用对小鼠生长、免疫球蛋白及AHR 受体等的影响，探讨螺旋藻作用机理，为饲料资源开发及畜禽健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 钝顶螺旋藻纯粉由山东博然螺旋藻生物股份有限公司生产，水分含量5.0%，蛋白质含量67.86%，色氨酸含量0.14%（实测值）。益生菌由开创阳光环保科技发展公司生产，枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌的量分别为 1.0×109、1.0×108CFU/g。体重（17±0.1）g的雌性无特定病原体（SPF）级昆明雌性小鼠购买于济南朋悦实验动物繁育有限公司。SPF 小鼠颗粒饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司生产，粗蛋白质21.46%，赖氨酸1.43%，色氨酸0.04%（实测值）。

1.2 试验设计与饲养管理 采用2×2 试验设计，将80只小鼠随机均分为4 组，每组5 个重复，每重复4 只，每单体笼饲养1 个重复。对照组饮用蒸馏水，螺藻组、益菌组、藻菌组分别饮用重量比为30 mg/kg 的螺旋藻蒸馏水溶液、60 mg/kg 的益生菌蒸馏水溶液、30 mg/kg螺旋藻+60 mg/kg 益生菌的蒸馏水溶液。每3 d 换1 次蒸馏水。试验期28 d。试验开始前与结束后一天08:00全部小鼠个体空腹称重，小鼠自由采食与饮水，环境温度控制在（25±1）℃，每周换2 次垫料，小鼠饲养试验过程按照国家《实验动物管理条例》执行。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生长性能 于试验第 7、14、21、28 天 08:00 全部小鼠进行个体空腹称重，以重复为单位记录采食量、饮水量，分别计算每只小鼠的始重（IW）、末重（FW）、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、耗料增重比（F/G）及日均饮水量（ADWI）。

1.2.2 粪便菌群 第 24 天 08:00 每组每重复随机选2 只小鼠采集新鲜粪便，待粪便排出后迅速装入已经灭菌的塑料管中，立即分析，分别采用MRS 培养基、伊红美蓝培养基进行平板计数法测定乳酸菌与大肠杆菌的数量。

1.2.3 血清免疫指标 第28 天空腹称重后当天小鼠全部脱颈致死，眼缘静脉采血，3 000 r/min 离心10 min，将血清于0～4℃冰箱保存备用。采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定血清中IgE、IgM、IgG 含量，酶标仪测定波长为450 nm。ELISA 试剂盒为武汉基因美科技有限公司提供。

1.2.4 AHR、TLR3 和 TLR4 含量 小鼠采血后，立即取回盲接口处至下端4 cm 的结肠肠段和肝脏组织，用生理盐水冲洗结肠内容物和肝脏表面，然后用滤纸吸干表面水分，-20℃保存备用。ELISA 测定结肠和肝脏中AHR、TLR3 和TLR4 含量，酶标仪测定波长为450 nm。ELISA试剂盒同上。

1.2.5 统计分析 先用Excel 2010 对试验数据进行初步整理，再用SAS 9.1 软件GLM 程序对所有数据按双因素模型进行处理，计算平均值与标准误，分析螺旋藻添加效应、益生菌添加效应及二者互作效应，采用Duncan's 方法对平均值进行多重比较。P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。数据结果用平均值表示。

2 结果与分析

2.1 螺旋藻和益生菌对小鼠生长性能的影响 由表1 看出，添加螺旋藻对FW 和ADG 皆有增高趋势（P＜0.05），降低ADFI 和F/G（P＜0.01）；添加益生菌增加ADFI（P＜0.01），降低了 F/G（P＜0.05）。SPI 和 PRO 二者对于F/G 交互显著（P＜0.05）。结果表明，添加螺旋藻可以促进小鼠的生长。

2.2 螺旋藻和益生菌对小鼠免疫蛋白的影响 由表2看出，螺旋藻和益生菌皆可以提高IgE 和IgM 的含量（P＜0.05），但二者互作皆不显著（P＞0.05）。二者对IgG 皆无影响。

2.3 螺旋藻和益生菌对小鼠结肠和肝脏受体的影响 由表3 可知，添加螺旋藻和益生菌皆提高了结肠中AHR含量（P＜0.05），但二者交互作用不显著（P＞0.05）；二者对TLR3 皆无显著影响；益生菌对结肠中TLR4 含量有显著影响。螺旋藻和益生菌二者皆极显著提高了肝脏AHR 含量，二者对肝脏TLR3 和TLR4 皆无影响。结果表明，饮水螺旋藻和益生菌可以提高结肠和肝脏AHR 受体含量。

2.4 螺旋藻和益生菌对小鼠粪便菌群的影响 由表4 可知，螺旋藻对粪便中的乳酸菌和大肠杆菌皆无影响，益生菌降低了粪便中大肠杆菌含量（P＜0.01），表明二者对粪便菌群的影响存在差异。

3 讨 论

3.1 螺旋藻和益生菌对小鼠生长与免疫的影响 本试验中饮水螺旋藻可以降低小鼠F/G，与粉状饲料添加螺旋藻可以促进猪生长的结果[3]相似，与螺旋藻颗粒饲料对断奶仔猪生长无影响的结果[7]相反，原因可能是颗粒饲料高温制粒破坏了螺旋藻中的功能物质。螺旋藻中的藻蓝蛋白、叶绿素a 等功能物质不耐热，易受热破坏。生产中饮水或饲喂螺旋藻时建议保护其功能物质的生理活性。本试验发现，螺旋藻与益生菌对于小鼠的F/G 互作效果明显，揭示螺旋藻中的营养物质或生理功能物质与枯草芽孢杆菌及乳酸菌在饲料转化方面可能存在协同作用，这与螺旋藻与益生菌协同促进鲤鱼生长[8]的结果相似。本试验结果显示，螺旋藻与益生菌在生产中协同使用的促生长效果更好。

IgE、IgM 是参与体液免疫的主要抗体，其含量在一定程度上可以反映机体的体液免疫水平。本试验中螺旋藻提高小鼠血清IgE、IgM 的含量，表明螺旋藻可以提高机体的体液免疫水平，这与肉鸡[9]及仔猪[3]上的结果相近。IgG 也是一种主要的免疫球蛋白，但本试验发现螺旋藻对小鼠IgG 无影响，具体原因有待进一步研究。Hayashi 等[5]报道，螺旋藻对绵羊红细胞二次免疫小鼠血清的IgG 几乎无影响；盛清凯等[3]报道，螺旋藻对未口蹄疫疫苗免疫仔猪的IgG 也没有影响，但可以提高口蹄疫疫苗免疫接种仔猪的IgG，据此推测螺旋藻对IgG 的影响可能与免疫接种或接种疫苗的类型有关。3.2 螺旋藻和益生菌对小鼠结肠和肝脏AHR、TLR3 和TLR4 的影响 AHR、TLR 皆为肠道和肝脏上的受体蛋白。AHR 是一种由饮食、微生物、新陈代谢物和污染物所提供的小分子配体激活的转录因子。AHR 被配体激活后，移位到细胞核内与芳香烃受体核转运蛋白形成异二聚体复合物，该异二聚体结合相应的 DNA 序列，引发下游目的基因的转录及表达。吲哚等为AHR的配体[10]。TLR 是一种重要的免疫细胞表面模式识别受体。细胞通过TLR 等模式识别受体，激活系列的级联信号通路，建立宿主的天然免疫反应，在机体肠道免疫调节中发挥重要作用。目前发现小鼠有11 种TLR（TLR1～TLR13），TLR 受营养物质调节[11]，脂多糖及病毒双链RNA 等分别是TLR4 和TLR3 的配体。TLR4 信号传导为Dy88T 依赖性或非依赖性传导，TLR3 为非依赖性信号传导。AHR 信号通路与TLR 免疫调节通路通过转录因子（NF-kb）进行交叉。AHR 信号通路将环境因素、饲粮新陈代谢物与免疫性能相衔接。

表2 螺旋藻和益生菌对小鼠免疫蛋白的影响 μg/mL

表3 螺旋藻和益生菌对小鼠结肠和肝脏AHR、TLR3 和TLR4 的影响

表4 螺旋藻和益生菌对粪便菌群的影响 lg CFU/g

目前未见螺旋藻对AHR 影响的报道。本试验中螺旋藻提高肠道AHR 与提高血清IgM、增强机体免疫性能的结果相对应，这与AHR 信号调节肠道免疫的结论[12]一致。这可能与自身色氨酸或脂多糖结构等有关。其一，螺旋藻作为一种高蛋白饲料原料，富含色氨酸。饮水后结肠食糜中色氨酸含量增加，导致吲哚等含量升高，促进AHR 产生。其二，螺旋藻含有脂多糖[13]，脂多糖可以促进免疫细胞AHR 的表达[14]。其三，与肠道菌群变化有关。菌群变化影响色氨酸的代谢[15]。目前发现拟杆菌、梭菌等多种微生物可以降解色氨酸产生吲哚及其衍生物，螺旋藻对仔兔盲肠拟杆菌等微生物有显著影响[16]。本试验对于降解色氨酸产生吲哚的梭菌等微生物没有检测。本试验中螺旋藻对TLR4 无影响的结果与Okuyama 等[13]不同，差异原因可能在于多糖为螺旋藻其中的一种功能成分。本试验发现，螺旋藻增强机体免疫力的机理与AHR 有关，有助于螺旋藻饲料添加剂及免疫增强剂的开发。

3.3 螺旋藻和益生菌对小鼠粪便菌群的影响 本试验中螺旋藻对小鼠乳酸菌、大肠杆菌无影响的结果与仔猪[3]近似，与体外培养基中螺旋藻促进乳酸菌生长、对大肠杆菌无影响[17]的结果不同。本试验螺旋藻对大肠杆菌无影响、益生菌降低大肠杆菌的结果间接表明螺旋藻与益生菌二者通过调整肠道菌群促生长增加免疫的机理存在差异。在实际生产中如果螺旋藻与益生菌配伍，二者可能从色氨酸、脂多糖、菌群等多个调控环节协同促进生长及增加免疫。

3.4 螺旋藻与益生菌联用对小鼠生长、免疫和菌群的影响 目前未见螺旋藻与益生菌联用对小鼠生长及免疫影响的试验报道。本试验中螺旋藻与益生菌对小鼠ADFI、F/G、IgE、IgM 及结肠AHR 有相同的显著影响，但益生菌对结肠TLR4 及粪便大肠杆菌有显著影响，而螺旋藻对结肠TLR4 及大肠杆菌皆无影响。螺旋藻与益生菌作用的差异，可能与二者含有的生理功能物质或分泌的功能物质或本身化学物质结构或有关。本试验所用的钝顶螺旋藻属于蓝藻门蓝藻纲螺旋藻属，含有藻蓝蛋白、叶绿素a 等生理功能物质；枯草芽孢杆菌属于厚壁菌门芽孢杆菌纲芽孢杆菌属，可以合成蛋白酶、纤维素酶等酶类；乳酸菌属于厚壁菌门芽孢杆菌纲乳杆菌属，可以分泌乳酸等物质。目前未见枯草芽孢杆菌或乳酸菌含有螺旋藻藻蓝蛋白以及螺旋藻分泌乳酸的报道。螺旋藻多糖和枯草芽孢杆菌多糖二者结构也存在差异。

本试验中螺旋藻与益生菌对F/G 有协同效果，对肝脏TLR3 和TLR4 有协同影响趋势，说明螺旋藻与益生菌二者强化了促进生长、增强免疫的相关功能。二者是否通过AHR、NF-kb、TLR 或其他信号通路协同强化，有待进一步研究。

4 结 论

饮水螺旋藻可以促进小鼠生长，提高机体免疫力，其机理与AHR 改变有关。螺旋藻可能通过富含的色氨酸、脂多糖及调节菌群等途径影响AHR。螺旋藻与益生菌二者促进生长、增加免疫的作用机理存在差异，二者配伍后应用效果更好。