新型格尔德霉素葡萄糖苷的制备及其诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用

李红梅，李 静，霍 强，金 勇，吴成柱

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害女性健康和生命[1-2]，向临床提供安全、有效的抗肿瘤药物是当今医药工作者的使命。热休克蛋白90(heat shock protein,Hsp90)在肿瘤细胞中的表达比正常细胞高2～10倍，并可调控众多信号蛋白的构象成熟和稳定性，在肿瘤细胞生长、分化、凋亡等方面发挥重要作用，已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点之一[3-5]。格尔德霉素(geldanamycin,GA)是第一个鉴定出的Hsp90抑制剂，虽然其抗肿瘤活性很强，但是由于具有肝毒性强、水溶性差等缺点，严重限制了临床上的应用[6-7]。糖基化修饰是提高化合物水溶性的最常用方法之一，不仅可以增加化合物的水溶性和稳定性，丰富结构多样性，并可改善药物在体内的药代动力学性质，有利于药物的药效发挥[8]。最近，本课题组通过体外酶法糖基化反应制备了若干个GA衍生物糖基化产物，但是对低毒性的非苯醌GA衍生物17-demethoxy-reblastatin(17-DR)糖基化产物的准确结构及其抗肿瘤活性未进行研究报道[9-10]。因此，本研究中将通过体外酶法糖基化法制备新型非苯醌GA糖基化衍生物，并利用ESI-MS和NMR波谱解析鉴定其结构，同时探讨和阐明新型非苯醌GA糖基化衍生物对Hsp90活性、人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的影响，为今后的持续研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 17-DR分子式为C28H42N2O7，由本课题组从StreptomyceshygroscopicusJCM- 4427菌株中提取分离得到，并经NMR数据分析并与文献[11]比较确认。DMEM培养基和胰酶购于Gibco公司；胎牛血清购于浙江四季青公司；二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、UDP-glucose(UDP-Glc)购自Sigma-Aldrich公司；碘化丙啶(PI)购买于 BD Bioscience公司；乙腈(色谱纯)购自Thermo Fisher公司；Akt抗体购于Cell signaling公司；Akt抗体购自Proteintech公司；Bcl抗体Hsp90α抗体购于Stressgen公司；其他常用试剂均为国产分析级。

1.2 细胞及其培养 人乳腺癌MCF-7细胞购于中科院上海细胞库。MCF-7细胞培养于DMEM培养基，加入10%胎牛血清、1×105IU/L青霉素、100 mg/L链霉素，置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养，并用0.25%胰酶消化后传代培养。

1.3 体外酶法糖基化反应 根据前期研究基础[9-10,12]，本研究中采用的体外酶法糖基化反应条件为：100 mL的 Tris-HCl反应缓冲液(100 mmol/L,pH 8.0)，其中包括1 mmol/L的MgCl2，50 μg/L的YjiC蛋白(糖基转移酶)，1 mmol/L 的UDP-Glc，1 mmol/L的底物(17-DR)，在30 ℃反应14 h。待反应结束后，于100 ℃沸水中煮沸10 min停止反应，并进行分析与精制。取适量的糖基化反应产物经高效液相色谱仪(Waters 2535Q，美国Waters公司)分析色谱条件为SunFireTMC18(4.6 mm×150 mm)色谱柱，梯度洗脱(0～20 min，20%～100%乙腈；20～30 min，100%乙腈)，流速为1 mL/min。糖基化反应液经Waters 2535Q半制备高效液相色谱进行精制，其色谱条件为SunFireTMC18(10 mm×250 mm)色谱柱，流动相(溶剂A为乙腈；溶剂B为水)，等度洗脱(0～30 min，10%溶剂A)，流速为3 mL/min，检测波长为254 nm，获得化合物1(11.5 mg)。

1.4 体外检测Hsp90 ATPase活性实验 将2 μmol/L的酵母Hsp90-his融合蛋白置于96孔板中，每孔加入不同浓度的化合物及Tris-HCl反应缓冲液(100 mmol/L的Tris-HCl；20 mmol/L的KCl；6 mmol/L的MgCl2；pH 7.4)，混均匀后置37 ℃反应2.5 h。待反应结束后每孔加入80 μL的malachite green-molybda溶液显色，并用酶标仪620 nm检测吸光度(A)，并计算出各化合物抑制Hsp90 ATPase活性的IC50值。以上实验重复3次[11,13]。

1.5 MTT法 将处于对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为6×103，并置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的17-DR(0、2.5、5、10、20、40、80、100 μmol/L)和化合物1(0、5、10、25、50、100、200、400 μmol/L)后 24、48、72 h后终止培养。每孔加入15 μL的MTT溶液在37 ℃孵育4 h，除去培养液，并加入DMSO 100 μL孵育10 min，用酶标仪在490 nm波长下检测每孔的A值，并计算细胞存活率。以上实验重复3次。

1.6 PI单染/流式细胞术检测细胞凋亡 将处于对数生长的MCF-7细胞按每孔1×105的密度接种于6孔板贴壁过夜后，按不同浓度化合物1(0、50、100、200 μmol/L)处理24 h后收集细胞，洗涤。用适量0.9%氯化钠溶液重悬细胞，加入30 μg/mL PI染色15 min，洗涤，再经300 μL 0.9%氯化钠溶液重悬细胞，上流式细胞仪(Becton Dickinson C6)进行检测。检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数，计算总数6000个细胞。

1.7 免疫印迹法检测蛋白表达 将MCF-7细胞接种于6孔细胞培养板3×105/孔，培养24 h后给予不同浓度的化合物1(0、50、100、200 μmol/L)。冰PBS 清洗后，滤纸吸干液体后加入细胞裂解液，每孔200 μL，置冰上30 min，刮下细胞，转移至1.5 mL离心管内置于-80 ℃冻存，经3 次反复冻融后用BCA 蛋白定量法测各组蛋白浓度，调蛋白浓度后加上样缓冲液，煮沸5 min变性。每组取蛋白40 μg，经SDS-PAGE 后转移至PVDF 膜，封闭过夜后，置相关蛋白的一抗(Akt、Bcl-2、Hsp90α)、二抗，ECL发光试剂盒发光、显影、定影，Bio-Rad凝胶成像系统获取图像。

1.8 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 糖基化产物的HPLC分析 HPLC分析结果(见图1)显示，非苯醌GA衍生物17-DR的体外酶法糖基化反应液中可观察到其糖基化产物峰的存在。17-DR峰(底物)的保留时间(tR)为8.8 min，与此对应的糖基化产物峰tR为7.2 min。

2.2 结构鉴定 化合物1为白色粉末，其分子式为C34H52N2O12，ESI-MS [M-H]-m/z679；1H-NMR(700 MHz,DMSO-d6)数据为：δH 9.45(-NH,s),7.0(1H,brd,H-19),6.54 (1H,s,H-17),6.49 (1H,s,H-21),5.80 (1H,brs,H-3),5.27 (1H,d,J=9.1 Hz),4.85 (1H,d,J=7.7 Hz,H-7),4.74 (1H,d,J=7.0 Hz,H-1′),3.69 (1H,d,J=10.5 Hz,H-6′),3.50 (1H,dd,J=5.6,10.5 Hz,H-6′),3.32 (3H,s,6-OCH3),3.22 (3H,s,12-OCH3),3.20 (1H,m,H-11),3.18-3.25 (overlap,H-6,H-3′,H-4′,and H-5′),3.0 (2H,m,H-12 and H-2′),2.34-2.60 (overlap,H-13 and H-15),2.33 (1H,m,H-10 ),2.14 (2H,m,H-4 ),1.75 (1H,m,H-14 ),1.71 (3H,s,H-22),1.39 (3H,s,H-23),1.23 (2H,m,H-5 ),0.90 (3H,d,J=6.3 Hz,H-24),0.78 (3H,d,J=5.6 Hz,H-25)；13C-NMR (175 MHz,DMSO-d6) 数据为：δC 170.7(C-1),157.6 (C-18),156.1 (7-OCONH2),141.5 (C-16),139.9 (C-20),134.7 (C-3),133.3 (C-9),131.9 (C-2),129.8 (C-8),117.0 (C-21),112.9 (C-17),106.7 (C-19),100.7 (C-1′),80.7 (C-7,C-12,and C-2′),79.4 (C-6),77.1 (C-5′),76.7 (C-3′),73.2 (C-11),69.6 (C-4′),60.6 (C-6′),58.3 (6-OCH3),56.4 (12-OCH3),42.7 (C-13 and C-15),33.9 (C-10),30.9 (C-14),29.7 (C-5),23.4 (C-4),19.1 (C-25),16.3 (C-24),13.1 (C-22),11.8 (C-23)。化合物1除了具有17-DR类似的波谱特征之外，还具有1分子葡萄糖单元信号[δH 4.74 (H-1′),3.0 (H-2′),3.18-3.25 (H-3′,H-4′,H-5′ ),3.69 (H-6′),3.50 (H-6′),和δC 100.7 (C-1′),80.7 (C-2′),76.7 (C-3′),69.6 (C-4′),77.1 (C-5′),60.6 (C-6′)][11]。进一步，根据HMBC确认了化合物1中的糖分子、甲氧基、7-氨基甲酰基等主要官能团的连接位置(H-1′/C-18,6-OCH3/C-6,12-OCH3/C-12,H-7/C-6,7-OCONH2,C-8等)(见图2)。因此，新化合物1的结构鉴定为17-demethoxy-reblastatin-18-O-β-D-glucopyranoside。

2.3 化合物1对Hsp90 ATPase活性的影响 本研究通过体外酶法糖基化反应制备了化合物1，并发现化合物1具有较强的特异性地抑制酵母Hsp90蛋白ATPase活性。结果显示，化合物1显著地抑制Hsp90活性，其IC50值为8.98 μmol/L，而经典的Hsp90抑制剂GA的IC50值为3.06 μmol/L (见表1)。

表1 化合物1抑制Hsp90 ATPase活性

q检验：与化合物1比较**P<0.01；与17-DR比较△△P<0.01

2.4 化合物1对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响 结果表明，化合物1具有一定的抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用，并呈现时间与浓度依赖性，作用于MCF-7细胞72 h的IC50值为81.84 μmol/L (见图3)。

2.5 化合物1对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响 PI染色/流式细胞术结果显示，化合物1具有一定的诱导MCF-7细胞凋亡的能力，并呈现浓度依赖性，不同浓度化合物1(50、100、200 μmol/L)其诱导肿瘤细胞凋亡率分别为5.4%、6.1%、14.3%，用200 μmol/L的化合物1处理细胞组诱导细胞凋亡与阴性对照组2.4%比较差异有统计学意义(P<0.05) (见图4)。

2.6 化合物1对乳腺癌MCF-7细胞内相关蛋白表达的影响 结果显示，Hsp90顾客蛋白Akt和Bcl-2随着化合物浓度的增加，其表达逐渐下调，呈现浓度依赖关系，而对Hsp90蛋白表达基本不产生影响 (见图5)。与阴性对照组相比，不同浓度的化合物1诱导Akt和Bcl-2蛋白下调率分别为5%、20%、51%和10%、29%、51%(见表2)。

化合物/(μmol/L)AktBcl-2Hsp90 0 1.00±0.021.00±0.151.00±0.11 50 0.95±0.030.90±0.010.86±0.04∗100 0.80±0.03∗0.71±0.05∗0.88±0.03∗200 0.49±0.07∗∗0.49±0.04∗∗0.87±0.04∗ F 25.20 15.817.09 P<0.01 <0.01<0.05 MS组内 0.005 0.008 0.010

与0 μmol/L组比较**P<0.01或*P<0.05

3 讨论

伴侣蛋白Hsp90在肿瘤的发生、发展及转移中起重要作用，Hsp90的顾客蛋白包括酪氨酸激酶受体(EGFR、Her-2)、亚稳信号蛋白(Akt、Raf-1)、突变信号蛋白( v-Src、p53)、转绿因子(HIF-1α)等，这些顾客蛋白均是当前抗肿瘤药物发现与开发的靶点[14]。目前已有多个Hsp90抑制剂进入了治疗乳腺癌临床试验阶段，并表现出良好的应用前景，如17-AAG、PF-4942947、PU-71等。GA作为Hsp90抑制剂的典型代表，具有很强的抗癌活性，但由于其水溶性差、肝毒性强等缺点，使其在临床应用上受到了限制[7]。寻求水溶性更好、不良反应更低的GA衍生物成为了GA系列抗癌新药研发的主要方向之一。因此，本研究以低肝毒性的17-DR为底物，通过体外酶法糖基化反应进行结构修饰，制备出了水溶性的新型非苯醌GA糖基化衍生物(1)，为今后的GA系列抗肿瘤药物研究提供物质基础。

天然药物具有结构独特、多样、低毒性等优点，亦是新药研发中先导化合物的重要来源之一。然而，某些天然产物因水溶性低、稳定性差等原因，极大地限制了其临床应用。研究[8,15]表明，糖基化结构修饰可增强化合物的稳定性，提高水溶性和靶向性，并改善活性和药代动力学性质。体外酶法糖基化法不仅操作简单、方便，有效地控制反应条件，并且可以精确地检测反应产物。本研究中使用的来源于BacilluslicheniformisDSM-13的糖基转移酶，具有广泛的底物选择特异性，可通过酚羟基或醇羟基将糖供体(NDP-sugar)上的糖分子连接至不同结构的底物[9-10,12,16]。本研究为鉴定化合物1 的化学结构，利用1D-NMR和2D-NMR解析确定了基本骨架、糖分子与苷元，其他主要官能团(甲氧基、氨甲酰基等)的连接位置。特别是通过糖分子端基质子信号的耦合常数(J=7.0 Hz)，确认了化合物1的葡萄糖苷键以β构型存在。

化合物1以Hsp90为靶点，同时作用于多条信号通路，比作用于单一信号通路的药物在抗肿瘤活性方面可具有一定的优势。化合物1作为GA衍生物，我们推测其可通过和ATP竞争性地与Hsp90的N-末端结合，继而通过泛素化蛋白酶途径降解其顾客蛋白。生物活性结果显示，化合物1抑制Hsp90 ATPase活性、MCF-7细胞增殖的作用，虽然活性强度与底物比较有所下降，这与GA系列糖基化修饰可降低体外活性的一些报道相吻合[17]。同时，化合物1具有诱导MCF-7细胞凋亡的作用，其可能机制是通过下调Hsp90顾客蛋白Akt和Bcl-2相关。有趣的是，不同浓度的化合物1对肿瘤细胞内Hsp90蛋白表达均没有影响，表明其抑制Hsp90活性只是抑制Hsp90 ATPase活性来抑制Hsp90伴侣功能，与以往的文献[13,18]报道一致。

综上所述，化合物1作为新型结构的非苯醌GA糖基化衍生物，具有抑制Hsp90活性、抗增殖及诱导凋亡的作用，有一定的应用前景。然而，本研究只探讨了化合物1的体外抗乳腺癌作用，体内抗乳腺癌作用及其机制尚有待进一步于深入研究。