青花菜钙依赖蛋白激酶基因BoCDPK1的克隆与表达

邬菲帆，王佳怡，戴晨宇，杨如棉，徐鹏杰，管 铭，张慧娟，蒋 明

(台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000)

青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)又名西兰花、青花椰菜和意大利芥蓝等，是十字花科(Cruciferae)芸薹属甘蓝类蔬菜[1]。青花菜以花球和花茎为主要食用部位，它们色泽翠绿、营养丰富，富含矿物质、膳食纤维、蛋白质和维生素，还含有具抗癌作用的硫苷类物质，青花菜已成为一种深受人们喜爱的保健蔬菜[2-3]。浙江是我国青花菜主产省，全省常年种植面积达1.33万hm2，花球产量占全国的40%[4]。近年来的调查发现，浙江青花菜产区菌核病和霜霉病的发生十分严重，甚至成片受害，给菜农造成巨大的经济损失。我国不是青花菜的原产地，种质资源极为匮乏，抗病材料更是稀缺；通过挖掘与青花菜抗病相关的功能基因，并开展分子育种，是种质创新的重要途径之一[5]。近年来的研究发现，钙信号转导途径在植物生长发育和逆境防御过程中起重要作用，其中的钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)是钙信号转导途径的组成因子，它参与多种Ca2+介导的信号途径，在抵御生物和非生物逆境中扮演着重要角色[6]。

Ca2+作为第二信使，参与植物发育和逆境防御过程的信号响应，而CDPK作为Ca2+传感蛋白，它们通过磷酸化离子通道蛋白、转录因子和代谢酶等底物，触发一系列的生理生化反应[7-8]。典型的CDPK具有1个S_TKc(serine/threonine protein kinases， 苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶)结构域和多个串联的EF手性(EF hand)结构域。S_TKc结构域通常由300多个氨基酸残基组成，用于结合ATP和调节蛋白酶活性，而EF手性结构域能与Ca2+亲和结合[9]。自首次从豌豆(Pisumsativum)中分离到CDPK以来，研究人员已在铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)、普通烟草(Nicotianatabacum)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、盐藻(Dunaliellasalina)、毛白杨(Populustomentosa)和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)等植物中克隆得到CDPK基因，并对部分成员进行了表达分析和功能鉴定[10-16]。但是，有关青花菜CDPK基因的研究未见报道。本研究以青花菜为材料，在克隆CDPK基因的基础上，利用qRT-PCR技术研究它们在霜霉菌和核盘菌侵染下的表达模式，为将来开展基因功能鉴定和抗逆分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取健康、饱满的Wx青花菜种子，播种于无菌基质(椰砖∶珍珠岩∶蛭石体积比1∶1∶1)，放入人工气候箱(温度22 ℃，16 h光照/8 h黑暗，相对湿度75%)中培育幼苗。在两叶一心期，选取生长健壮、长势一致的幼苗移栽至新的无菌基质中。霜霉菌的接种采用喷雾法，在0、6、12、24、36、72、96 h采集叶片。核盘菌的接种采用菌丝块法，用直径为6 mm的无菌打孔器切取琼脂块，具菌丝一侧贴于叶片上表面，对照采用空白PDA块，接种处理0、6、12、24、36、72 h采集叶片，每个处理设置3个生物学重复。叶片置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于后续的DNA或RNA提取。实验材料对菌核病和霜霉病均表现为低感，接种核盘菌12 h，PDA接触位置开始发黑，72 h病斑变大，并发生腐烂；接种霜霉菌72 h，叶面出现少量枯斑，7 d病斑较多，周围出现明显的褪绿圈，叶背出现霉层。

1.2 方法

1.2.1 DNA和RNA提取

基因组DNA和RNA的提取采用试剂盒法，试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；RNA提取采用TaKaRa的MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒，实验操作根据说明书进行。DNA和RNA经电泳检测后，置于-80 ℃冰箱保存备用。cDNA的合成采用TaKaRa公司的试剂盒，操作按说明书进行。

1.2.2 青花菜CDPK基因的克隆

根据野甘蓝(B.oleraceavar.oleracea， XP_013613262)和甘蓝型油菜(B.napus， NP_001302636)的CDPK基因序列设计PCR引物，上游和下游引物分别为5′-ATGGGCAATTCATGCCGTGG-3′与5′-CTAAGCGTCTCTCATGCTAATGTTCAG-3′。在20 μL反应体系中，加入14.3 μL ddH2O、2.0 μL缓冲液(含20 mmol·L-1Mg2+)、0.5 μL dNTPs(10 mmol·L-1)、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物(20 μmol·L-1)、2.0 μL模板DNA(20 ng·μL-1)和0.4 μLTaq酶(2 U·μL-1)。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共32个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 PCR产物的回收、转化和测序

PCR产物经凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收片段，试剂盒购自碧云天生物技术研究所。连接采用TaKaRa试剂盒，在PCR管中依次加入5 μL T4 DNA连接缓冲液、1 μL T-easy载体、3 μL回收产物和1 μL T4 DNA连接酶，置于4 ℃冰箱中连接过夜。经转化、单菌落挑取和菌液PCR鉴定，取3个阳性克隆测序。

1.2.4 BoCDPK1基因的序列分析

用SMART工具(http://smart.embl.de)预测编码蛋白的结构域；借助MEGA-X软件构建系统发育树，建树方法为邻接法(neighbour-joining)，经1 000次自举检测。BoCDPK1的同源蛋白序列下载自NCBI，它们分别来自陆地棉(Gossypiumhirsutum)、海岛棉(G.barbadense)、雷蒙德氏棉(G.raimondii)、甘蓝型油菜(B.napus)和芜菁(B.rapa)等。

1.2.5BoCDPK1基因表达分析

根据测序得到的序列，设计qRT-PCR上下游引物，分别为：5′-TCCATCACCATCACCCACGTTTC-3′和5′-GGTTCTTTCACGGGAAGCACAAG-3′。以肌动蛋白基因为内标，引物为：5′-ACGTGGACATCAGGAAGGAC-3′和5′-GAACCACCGATCCAGACACT-3′。qRT-PCR反应在Roche LightCycler 96上进行，分别加入10 μL 2 × Master Mix、上下游引物各0.2 μL(20 μmol·L-1)、2.5 μL cDNA和7.1 μL ddH2O；反应程序为95 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，59 ℃退火15 s，68 ℃延伸20 s，共40个循环。用2-ΔΔCt计算相对表达量，每个样品技术重复3次。利用SPSS 22.0进行单因素方差分析，差异显著性比较采用Duncan’s新复极差法。

2 结果与分析

2.1 BoCDPK1基因及其编码蛋白的特征

分别以叶片基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增，经转化和测序，得到各自的核苷酸序列(图1)。结果表明，BoCDPK1的基因组DNA全长为2 414 bp，具7个外显子和6个内含子，第1外显子最长，为730 bp，第6外显子次之，长度为225 bp，第7外显子最短，仅111 bp；内含子均符合GT-AG规则，长度范围为76～354 bp，第1内含子最长，第5内含子次之，为88 bp，第4内含子最短(图2)。

BoCDPK1的编码区全长为1 647 bp，编码548个氨基酸。经SMART在线工具预测，BoCDPK1具1个S_TKc结构域和4个EF手性结构域(图3)。S_TKc结构域位于+89-+347处，而4个EF手性结构域分别位于+394-+422、+430-+458、+466-+494和+500-+528。

A—基因组DNA模板；B—cDNA模板。M，DNA标准分子质量；1和2为PCR产物。 A-genomic DNA as template; B-cDNA as template。M， DNA marker; 1 and 2， PCR products.图1 BoCDPK1基因的克隆Fig.1 Isolation of BoCDPK1 gene

方框表示外显子，直线为内含子。 Boxes indicated exons， and lines showed introns.图2 BoCDPK1基因的结构Fig.2 The gene structure of BoCDPK1

2.2 BoCDPK1的系统发育分析

从NCBI下载BoCDPK1的同源序列进行多重比对，这些序列中，拟南芥CDPK(OAP08681)参与气孔开闭，还与受伤导致的乙烯生物合成相关；其他基因的功能未知。序列比对结果表明，BoCDPK1与甘蓝型油菜、芜菁和野甘蓝(B.oleraceavar.oleracea)的序列相似性较高，仅个别氨基酸残基存在差异。与野甘蓝相比，BoCDPK1在+47、+48和+52位存在N氨基酸的缺失。与4种芸薹属植物相比，拟南芥CDPK序列上存在多处插入、缺失和变异现象(图4)。3种棉属植物CDPK序列之间也十分保守，仅在个别氨基酸残基上发现差异，但它们与其他物种CDPK的序列差异较大。

系统发育分析结果表明，青花菜BoCDPK1与3种芸薹属植物的CDPK处于同一分支，支持率达100%，它们再与山嵛菜(Eutremasalsugineum， XP_024016164)聚于一组，支持率较小，仅为53%；3种棉属植物聚于同一分支，支持率达100%，它们与大戟科(Euphorbiaceae)的麻风树(Jatrophacurcas， XP_020535061)和蓖麻(Ricinuscommunis， NP_001310655)聚于一组；十字花科的亚麻荠(Camelinasativa， XP_010467489)和荠(Capsellarubella， XP_006297360)聚于一组，支持率为89%；而山柑科(Capparaceae)的醉蝶花(Tarenayahassleriana， XP_010548179)与豆科(Leguminosae)的大豆(Glycinemax， XP_003519696)单独成组(图5)。

划线部分为S_TKc结构域；高亮部分为EF手性结构域。 The underlined residues indicated the S_TKc domain; The highlighted residues showed EF-hand domains.图3 BoCDPK1基因及其编码蛋白序列Fig.3 Gene sequence of BoCDPK1 and its deduced protein sequence

图4 BoCDPK1部分序列及其同源蛋白的比较Fig.4 Comparisons of partial BoCDPK1 and its homologous sequences

2.3 BoCDPK1的表达分析

为明确BoCDPK1在霜霉菌和核盘菌侵染下的表达特点，以cDNA为模板，利用qRT-PCR进行定量分析。结果表明，BoCDPK1的表达受霜霉菌和核盘菌的诱导，相对表达量呈先上升后下降的规律。在霜霉菌侵染下，6～12 h的表达量未见显著变化，24、36、72、96 h的表达量为对照的1.79、2.24、3.4和1.64倍(图6-A)。在核盘菌侵染下，6～72 h的表达量显著上升，其中24 h和36 h的表达量分别为对照的2.4和3.5倍(图6-B)。

3 讨论

钙调蛋白(calmodulin)、钙调磷酸酶B类似蛋白(calcineurin B-like protein)、钙调素类似蛋白(calmodulin like protein)和CDPK为常见的Ca2+传感蛋白，它们根据Ca2+浓度调控下游产生级联反应，其中的CDPK通过磷酸化作用调节基因的表达[17]。CDPK参与植物生长发育，牵牛(Pharbitisnil)PnCDPK1基因的表达受光照诱导，在种子萌发、幼苗生长、花形成和果实成熟过程中起着重要作用[18]；马铃薯(Solanumtuberosum)StCDPK1和StCDPK3在匍匐茎中表达，与块茎早期发育和膨大相关[19]；烟草NtCDPK1在根尖、茎尖和花蕾中表达，与细胞分裂、分化和凋亡相关[20]；拟南芥CDPK28在胚根、根、子叶、莲座叶、花和果荚中表达，表明它参与拟南芥的生长发育过程[21]。本研究从青花菜中克隆到1个CDPK基因，在明确序列特征的基础上，进行了表达和系统发育分析。多序列比对发现，BoCDPK1与其他物种的N端变异较大，为高度可变区域，但它们的S_TKc结构域和EF手性结构域高度保守，与前人的研究结果吻合[22]。EF手性结构域为CDPK的调控域，可与Ca2+高度亲和结合，序列突变将影响亲和性[23]。

图5 BoCDPK1及其同源序列的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of BoCDPK1 and its homologous sequences

A—霜霉菌；B—核盘菌。不同处理间没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。 A-Hyaloperonospora parasitica; B-Sclerotinia sclerotiorum. The bars with different letters showed the significant difference (P<0.05).图6 青花菜BoCDPK1基因在病原菌胁迫下的表达Fig.6 Expression of broccoli BoCDPK1 gene challenged by pathogens

CDPK还参与逆境响应，与多种非生物胁迫和生物胁迫有关。拟南芥CDPK28的表达受NaCl和甘露醇诱导，它过量表达会积累较多的脯氨酸，耐盐能力显著提高[21]。Urao等[24]研究发现，干旱胁迫与盐胁迫均能诱导拟南芥AtCDPK1和AtCDPK2基因的表达；蚕豆CDPK基因VfCPK主要在叶片下表皮表达，在干旱胁迫下，VfCPK1的表达量显著增加[25]；水稻(Oryzasativa)OsCDPK7的表达受低温和盐胁迫诱导，它的过量表达能显著提高水稻的耐寒、耐盐和耐旱能力[26]；崔喜艳等[27]的研究表明，羊草(Leymuschinensis)LcCDPK基因的表达受干旱及盐碱胁迫的诱导，推测LcCDPK参与羊草抵御逆境胁迫的响应。CDPK参与生物胁迫，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)CDPK3的表达受苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)诱导，表达量在接种1 h达到最大值[28]。本研究利用qRT-PCR检测青花菜BoCDPK1基因的表达情况，发现该基因的表达受霜霉菌和核盘菌的诱导，但在表达时间和表达量上存在着一定的差异，说明BoCDPK1在霜霉菌和核盘菌胁迫下具有不同的响应模式。

近年来，有关CDPK与病原菌互作相关的研究不多，与霜霉菌和核盘菌相关的研究未见报道。本研究在克隆BoCDPK1基因的基础上，初步明确了它的序列特征、系统发育关系及其在霜霉菌和核盘菌侵染下的表达模式，为后续开展基因功能鉴定和抗病分子育种奠定了基础。下一步将利用遗传转化技术，通过BoCDPK1的抑制或过量表达研究其在青花菜抗病反应中的生物学功能。