瓜蒌薤白半夏汤调节Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化的疗效与机制研究

李金曦，赵吉艳，王均宁，沈仲琪，张义敏，2，董振飞，2*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省中医经典名方协同创新中心，山东 济南 250355)

动脉粥样硬化( atherosclerosis,AS)是心血管系统常见疾病[1],是众多心脑血管疾病的共同病理基础[2]。流行病学研究显示：我国以动脉粥样硬化为病理基础的心血管疾病致死、致残率极高[3]，且呈逐年上升趋势[4]。《中国心血管病报告2017(概要)》表明，至2017年我国已有心血管病患者2.9亿，死亡率居首位，高于肿瘤及其他疾病[5]。积极推进抗AS药物的药物研发及研究其药理作用机制, 对防治AS类疾病具有重要意义[6]。

AS是复杂的慢性进行性疾病，是冠心病的病理基础，现代临床中医常从“胸痹”论治。仲景在《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》所创的瓜蒌薤白半夏汤即为治疗胸痹的经典名方，因其治疗胸痹病效专力宏，故颇受历代医家之重视。原文曰：“胸痹不得卧，心痛彻背者，栝楼薤白半夏汤主之。”此方瓜蒌实一枚、薤白三两、半夏半升、白酒一斗组成，功擅通阳散结，祛痰宽胸，适用于胸痹痰浊结聚较甚者。

本实验中使用的Apoe-/-小鼠已成为近几年研究AS最常用的实验动物[7]，因其体内缺乏参与脂蛋白转化代谢的载脂蛋白e基因致使血液中胆固醇堆积而更易形成AS病灶。该模型因其未受物理损伤干预，发病过程及病变部位与人类十分相似而成为目前研究AS类疾病的极佳动物模型[8]。本研究通过复制Apoe-/-小鼠AS模型，对瓜蒌薤白半夏汤调节血脂代谢、减小主动脉斑块面积、改善血管内皮功能等方面进行研究，探讨瓜蒌薤白半夏汤抗AS的作用机制，为该方临床应用提供现代医学依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

瓜蒌、薤白、清半夏购于济南建联中药店，许可证号：鲁20160039；糯米酒(酒精度8%)购于济南大润发超市，许可证编号：SC10333021205725。辛伐他汀片，世贸天阶制药(江苏)有限责任公司，H20063015。

1.1.2 动物与饲料

32只SPF级健康雄性Apoe-/-小鼠，8周龄，体质量18～22 g和同遗传背景C57BL/6J小鼠8只，8周龄，体质量18～22 g；购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物质量合格证号：SYXK(鲁)20110019；动物饲养于山东中医药大学实验室IVC独立通风系统小鼠笼。高脂饲料由山东解螺旋生物科技有限公司提供 (TP-26300),普通饲料( SCXK鲁 20180003)与动物垫料均由济南朋悦公司提供，均经过高温灭菌处理。本研究中所有动物实验饲养及操作严格遵守国家动物福利伦理与保护相关规定。

1.1.3 主要设备和器械

电子天平：杭州万特衡器有限公司；移液器：Finnpipette；全自动雪花制冰机：上海政泓实业有限公司；立式压力灭菌器：重庆雅马拓科技有限公司，SQ510C；高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；酶标仪：Rayto，RT-6100；电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司，HWS-26型。

1.1.4 主要试剂

小鼠氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)ELISA试剂盒(晶美公司，JM-02354M2);小鼠一氧化氮(NO)ELISA试剂盒(晶美公司，JM-02938M1);小鼠内皮素1(ET-1)ELISA试剂盒(晶美公司，JM-02844M2);小鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)ELISA试剂盒(晶美公司，JM-02490M1)。

1.1.5 中药制备

瓜蒌薤白半夏汤原方换算如下：瓜蒌实(捣碎)30 g，薤白45 g，半夏60 g。以上为成人每日所需用药剂量，按小鼠体表系数9.1折算得等效剂量。瓜蒌4.55 g/kg,薤白6.825 g/kg,半夏9.1 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 模型制备

适应性饲养1周后，Apoe-/-小鼠给予高脂饲料饲养，自由饮水，持续时间12周。

1.2.2 分组及给药

12周末造模结束，Apoe-/-小鼠随机分为GXBD组、辛伐他汀组、模型对照组，每组各8只，持续高脂饮食。C57BL/6J小鼠设为空白对照组，普通饲料喂养。按体质量灌胃给药，每日1次，连续10周。

1.2.3 动物组织采集与处理

取材前夜动物禁食不禁水，麻醉后固定，剪开腹部，进行下腔静脉取血静置2 h，3 000 r/min，低温高速离心15 min，取上清，置于-80 ℃保存。取血后剪开胸腔，剪去胸骨，暴露心脏，自主动脉根部至髂总动脉分支处完整分离主动脉，完整取出主动脉，置于PBS缓冲液洗净血液，并分离净多余脂肪组织及纤维组织后置于4%多聚甲醛固定。

1.2.4 血清指标

采用全自动生化分析仪检测血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)水平。酶联免疫吸附试验测定血清NO、ET-1、AngⅡ、OX-LDL的浓度。

1.2.5 组织病理分析

主动脉油红O染色，观察小鼠主动脉内脂质沉积及斑块面积，测量主动脉斑块面积(PA)和管腔面积(LA)，计算斑块面积与管腔面积之比(PA/LA)。主动脉HE染色切片，观察主动脉组织结构的病理改变。

1.2.6 数据处理

2 结果

2.1 小鼠主动脉油红O染色

油红O染色能特异性地使组织和细胞内脂质以及脂蛋白等染色，呈红色部位说明存在动脉粥样硬化斑块。如图2所示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠PA/LA显著增加(P<0.01); 与模型对照组相比, GXBD组的PA/LA显著降低(P<0.01)。见图1、图2。

2.2 主动脉横截面HE染色

图3A：正常对照组,血管平滑肌细胞形态结构正常，排列规则，各层分界清晰，血管内皮结构完整，未见明显炎症，未见AS斑块形成。图3B：模型对照组,血管内膜增厚，动脉血管管腔出现粥样硬化斑块，血管平滑肌细胞形态结构紊乱，排列不规则，有散在泡沫细胞和炎症细胞。图3C：GXBD组,血管平滑肌细胞形态结构正常、分界清晰、排列规则；血管腔内可见少量脱落的细胞。图3D：辛伐他汀组,血管平滑肌细胞形态结构正常、分界清晰、排列规则；血管腔内可见较多脱落的细胞(黑色箭头)，并伴有单个淋巴细胞浸润。

图1 主动脉油红O染色

图2 斑块面积/管腔总面积(PA/LA)

2.3 瓜蒌薤白半夏汤对Apoe-/-敲除小鼠血脂的影响

AS的发生是由于脂质聚集在血管壁，伴随复合糖类积聚、纤维增生和钙质沉着，因此调节和减少脂质聚集对于抗AS有着重要意义[9]。结果显示，与空白对照组比较，模型对照组血清中的TC、TG、LDL-C水平较正常对照组明显升高(P<0.01)，HDLC明显降低(P<0.01)，GXBD组TC、LDL-C水平较模型组显著降低(P<0.01)，TG有降低趋势(P>0.05)，HDL-C水平较模型组升高(P<0.05)，见表1，图4～7。

注：A正常对照组；B模型对照组；C GXBD组；D辛伐他汀组图3 主动脉形态学改变 HE染色(HE×200)

2.4 瓜蒌薤白半夏汤对Apoe-/-小鼠血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ的检测

与空白组比较，模型组NO浓度显著降低(P<0.01)，给药干预后，瓜蒌薤白半夏汤组NO表达量相对模型组显著升高(P<0.01)，模型组ET-1与空白组相比显著升高，中药组显著降低(P<0.01)，可以说明瓜蒌薤白半夏汤干预能升高血清NO的表达，减少ET-1的表达，能够有效的改善血管收缩舒张功能的紊乱。模型组AngⅡ与空白组比较显著升高(P<0.01)，中药组AngⅡ表达量相对模型组有显著降低(P<0.01)，模型组ox-LDL与空白组相比显著升高，中药组显著降低(P<0.01)，说明瓜蒌薤白半夏汤的干预能够减轻氧化损伤，缓解血管平滑肌紧张，有效改善血管收缩舒张功能的紊乱,见表2,图8～11。

表1 瓜蒌薤白半夏汤对小鼠血脂水平的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 瓜蒌薤白半夏汤对血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ的影响

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，▲▲P<0.01

注：与空白组相比，**P<0.01;与模型组相比，▲▲P<0.01图4 瓜蒌薤白半夏汤对TC的影响

注：与空白组相比，**P<0.01;与模型组相比，▲▲P<0.01图5 瓜蒌薤白半夏汤对TG的影响

注：与空白组相比，**P<0.01;与模型组相比，▲▲P<0.01图6 瓜蒌薤白半夏汤对HDLC的影响

注：与空白组相比，**P<0.01;与模型组相比，▲▲P<0.01图7 瓜蒌薤白半夏汤对LDLC的影响

注：与空白组相比，**P<0.01;与模型组相比，▲▲P<0.01图8 瓜蒌薤白半夏汤对血清NO的影响

注：与空白组相比，**P<0.01;与模型组相比，▲▲P<0.01图9 瓜蒌薤白半夏汤对血清ET-1的影响

注：与空白组相比，**P<0.01;与模型组相比，▲▲P<0.01图10 瓜蒌薤白半夏汤对血清AngⅡ的影响

注：与空白组相比，**P<0.01;与模型组相比，▲▲P<0.01图11 瓜蒌薤白半夏汤对血清ox-LDL的影响

3 讨论

《内经》云：“脉不通则血不流。”中医学认为“心主血脉”，AS的发生主要由于心主血脉功能的失调，血脉不通，脉体失养所致。若心阳不振，导致血液运行失去动力，从而发生气滞血瘀，使血行迟滞，血脉痹阻。本研究采用Apoe-/-小鼠采用高脂饮食喂养12周，发病机理为过食肥甘厚腻，阻碍脾胃，运化不利，痰浊内生，结聚脉络，阻滞血脉，血脉通行受阻致病。

研究表明，瓜蒌薤白半夏汤的现代药理学作用机制主要表现为再灌注时对心肌损伤的保护，抑制血小板聚集[10]、抗心肌缺血[11]等方面，现代临床中，该方在冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗中疗效显著。AS被认为是动脉壁的慢性炎症性疾病[12]，内皮功能的障碍是AS发生的初始步骤[13]，研究显示，该方可通过调节脂质代谢，抑制氧化应激，减轻炎症反应等多种机制有效抑制动脉血管内皮的损伤。在血管内皮受到损伤后，内皮屏障功能减弱，从而引起脂质浸润增加，白细胞黏附迁移、NO生物活性减低、平滑肌细胞增殖、斑块的不稳定性增加，引起血栓的形成[14]。血管收缩因子主要包括内皮素(ET)、血管紧张素(Ang)、血栓素(TXA)等，ET-1由血管内皮细胞分泌，是NO的反向调节物质，ET-1水平与AS严重程度呈正相关，内皮损伤或ET释放增加，会增强血管收缩，促进平滑肌增生，致使斑块形成和扩大，引起血管重塑障碍。血管舒张因子主要包括一氧化氮(NO)，前列腺素(PGI)等。据1980年，Furchgott和Zawadzki的首次报道证实了内性NO作为天然血管保护因子和抗动脉粥样硬化分子具有重要的病理生理学意义[15]。内皮细胞依赖性的血管收缩舒张功能是目前公认的内皮功能障碍评价标准[16]，内皮功能障碍是导致AS发生的始动环节，因此，本研究认为对内皮功能紊乱进行有效干预和改善成为防治AS的重要环节，本实验方案的确定立足于血管收缩与舒张功能的紊乱是AS发生的重要因素，动脉血管内皮损伤是导致AS发生的主要条件，NO的产生减少引起的内皮舒张功能减弱是血管内皮功能紊乱的直接原因，通过检测NO、ET-1系统的平衡，及AngⅡ、ox-LDL的表达，试图进一步揭示瓜蒌薤白半夏汤对动脉血管内皮的保护功能，抑制AS发展的机制。

本研究以Apoe-/-小鼠给予高脂饮食饲养复刻AS模型，探讨了瓜蒌薤白半夏汤在调节血脂水平，调节主动脉斑块面积，以及调节血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ方面的作用。研究结果显示，GXBD组小鼠血清TC、TG、LDL-C与模型组相比明显下降(P<0.05)，HDL-C水平明显升高(P<0.05)，说明瓜蒌薤白半夏汤可以较好的改善小鼠血脂水平。油红O染色显示瓜蒌薤白半夏汤能明显减小主动脉斑块面积；HE染色结果显示瓜蒌薤白半夏汤组血管平滑肌细胞形态结构正常、分界清晰、排列规则，说明瓜蒌薤白半夏汤能有效抑制小鼠动脉AS的形成与发展。瓜蒌薤白半夏汤组血清NO的表达较模型组显著升高(P<0.05)，ET-1、ox-LDL、AngⅡ较模型组显著降低(P<0.05)，说明瓜蒌薤白半夏汤能够有效保护血管内皮、减轻氧化损伤，缓解血管平滑肌紧张，改善血管收缩舒张功能紊乱，调节血管内皮功能障碍。以上研究结果表明，瓜萎薤白半夏汤给药干预10周能够显著抑制高脂饮食12周诱导的动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块的发展，其调节血脂水平，升高血清NO浓度，抑制血清ET-1、ox-LDL、AngⅡ表达的作用，可能是其防治AS的部分机制。