高剪切法提取香蕉皮总多酚的工艺优化

张苗，张洁，代斌

(石河子大学化学化工学院，新疆 石河子 832003)

香蕉(MusananaLour.)是芭蕉科芭蕉属植物，其果实营养丰富，且活性价值高，果皮也被广泛用于传统中医药治疗口腔炎症和促进肠蠕动[1]。香蕉皮占全果重量的30%～40%左右[2]，因其中含有大量的维生素和矿物质，已被作为化妆品的生产原料；此外，香蕉皮还含有丰富的植物多酚类化学物质[3]，具有独特的抗衰、抗氧化、修复氧化细胞以及保护细胞不被损伤的功效[4]。植物多酚可通过抗氧化而防止肝脏病变[5]，存在于茶和石榴中的多酚已被证明可以保护肝脏免受酒精相关的损害[6]。

目前，国内外对香蕉皮多酚的提取已有一些研究[7-9]，但存在提取成本高、耗能、时间长效率低、难以实现工业化等各种缺陷。近几年发展的高剪切法是可以辅助溶剂提取的新技术，其极高的剪切速度和高频的机械效应可以强化溶解、分散、混合、萃取等过程，提取中可使细胞壁快速破损，有效组分在极性相似的溶剂作用下很快溶出，从而高效获得香蕉皮中的有效组分。高剪切具有普通提取方法无法达到的提取效果，尤其适用于天然物质的植物活性成分，同时，高剪切具有操作简单、耗能低、原料使用量少和组分提取时间较短的优点，比溶剂连续提取、微波、超声等方法的效率大幅提高[10-14]。研究[15-17]表明，高剪切法不仅可以提高有效组分的得率、节省提取时间，还能保持活性组分的生物活性。

由上述研究可知高剪切是一种简单、快速、绿色、高效的天然产物提取方法，因此，利用高剪切提取的诸多优势，本文实验通过高剪切辅助乙醇溶剂提取香蕉皮中的总多酚，首先采用单因素实验考察料液比、乙醇溶剂的浓度、高剪切实验设备的参数等对香蕉皮冻果中总多酚提取得率的影响，确定较优参数范围，然后借助响应面法(RSM)[18-19]对实验工艺进行分析和优化，以期得到香蕉皮冻果中总多酚提取的最优条件。

1 材料与方法

1.1 原料

购买颜色亮丽、无破损、无氧化的新鲜香蕉，取香蕉皮，热烫钝化多酚氧化酶[20]，40 ℃烘至香蕉皮质量不再改变，剪碎成小粒，冷冻保存。

1.2 仪器与试剂

采用仪器如下：FA25型弗鲁克间歇式高剪切分散乳化机(上海Fluko科技发展有限公司)、AL04万分之一精密天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、Bioridge RG-160AT离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、OSB-2200恒温反应槽(东京理化器械株式会社)、Cintra 20紫外-可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司)。

采用试剂如下：没食子酸标准品(Alfa-Esa(中国)化学有限公司)、福林-酚(Folin-Ciocalteu)试剂(TCI(上海)化成工业发展有限公司)、无水乙醇等其余分析纯试剂(上海Admas-Beta试剂有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 香蕉皮多酚的提取

称取适量解冻的香蕉皮放置于广口剪切瓶中，缓慢加入乙醇溶液140 mL，将上述溶液高剪切一定时间后静置，待其杂质沉淀后，取上层清液置于离心机中10 000 r/min离心3 min后得到样品。

1.3.2 香蕉皮多酚含量的检测

(1)溶液的配制。精确称量没食子酸标准品50 mg，将其置于500 mL容量瓶中后加入适量蒸馏水溶解，振摇混匀后定容至刻度，配制为100 μg/mL没食子酸标准溶液备用；再称取干燥的无水碳酸钠固体50 g，加去离子水适量，定容至500 mL容量瓶，配制为10%的碳酸钠溶液，备用。

(2)福林-酚法测定条件的确定。精确量取没食子酸标准溶液0.1 mL，稀释100倍，分别考察Folin-Ciocalteu用量、碳酸钠与Folin-Ciocalteu用量比、最大吸收波长、反应温度、反应时间，由此确定适合香蕉皮多酚的检测条件，其中测量液体∶Folin-Ciocalteu∶10%碳酸钠溶液体积比为1∶4 ∶16，测定条件为40 ℃恒温，反应时间30 min，测量波长760 nm。

(3)标准曲线的绘制。分别向10 mL比色管中移取体积为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的标准没食子酸溶液，依次加入Folin-Ciocalteu试剂0.4 mL、10%碳酸钠溶液1.6 mL后定容，于40 ℃的恒温槽中遮光反应30 min，取出放至室温，于760 nm测定吸光度值，以均值绘制标准曲线，结果如图1所示，标准曲线的方程如下：

y=0.123 1x+0.003 7，R2=0.999 7。

图1 没食子酸溶液标准曲线

(4)测定多酚含量。移取0.1 mL香蕉皮多酚提取物，以确定的Folin-Ciocalteu法检测条件，测量吸光度，香蕉皮冻果中总多酚的得率由标准曲线方程计算得到，多酚得率的计算公式如下：

(1)

式(1)中，M为总多酚的得率(mg/g，GAE/Fw)，以标准没食子酸计算，y是样品提取物的吸光度值；V为溶剂体积(mL)，m为香蕉冻果皮的质量(g)。

1.3.3 高剪切提取单因素试验

采用高剪切辅助乙醇法提取香蕉皮多酚，通过试验考察4个单因素对香蕉皮多酚得率的影响，4个因素分别为液料比、乙醇体积分数、剪切转速和剪切时间。不同因素设定不同水平，通过试验确定不同因素的较优范围。

1.3.4 响应面法优化试验

为了优化多酚的提取条件，以单因素试验结果为基础，以香蕉皮总多酚的提取含量为指标和响应值，采用以上4个因素设计四因素三水平的试验方案。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比的影响

分别称取解冻后的香蕉皮28、14、7、4.67、3.5 g于剪切瓶中，加入140 mL乙醇溶液(40%)，分别对应液料比为5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1，以13 000 r/min的剪切转速，高速剪切3 min后静置，待分层澄清后取上层清液，于离心机中以10 000 r/min的速度离心3 min后获得总多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法最优反应及测试条件测定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)计算得到，液料比的影响结果如图2所示。

图2 液料比的影响

由图2可以看出：物料多对香蕉皮多酚的提取不利。其原因是，由于物料量越大，溶剂粘度也随之大，物料得不到充分的剪切，同时还会发生空转现象，不断增大实验的溶剂量会造成植物总多酚产量增多。液料比为20∶1时，香蕉皮冻果中总多酚的得率为5.43 mg/g，达到峰值，当继续增大溶剂量时，植物总多酚的得率开始减小。由此可知，最佳液料比为20∶1。

2.1.2 乙醇体积分数的影响

称取6份解冻的香蕉皮，每份7 g，加入剪切瓶中，固定液料比20∶1，分别加入浓度为20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液140 mL，以剪切转速13 000 r/min高速剪切3 min后静置，待固液分层澄清后取上层清液，于离心机中以10 000 r/min离心3 min后获得总多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反应及测试条件测定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)计算得到，乙醇体积分数的影响结果如图3所示。

由图3可知：香蕉皮冻果中提取出的多酚与乙醇溶剂的体积分数有关，乙醇体积分数为40%时，香蕉皮中提取出的多酚达到最大值5.48 mg/g，增加或者降低这一乙醇浓度时香蕉皮多酚的得率都明显下降。香蕉皮中多酚类物质的极性更接近于40%的乙醇极性，因此在该浓度下多酚能够大量溶出，所以乙醇浓度选择40%。

图3 乙醇体积分数的影响

2.1.3 高剪切转速的影响

分别称取解冻的香蕉皮7 g 5份于剪切瓶中，固定液料比20∶1，加入40%乙醇溶液140 mL，根据高剪切分散乳化机的5个标准设定速度为10 000、13 000、16 000、19 000、22 000 r/min，高速剪切3 min后静置，待固液分层澄清后取上层清液，于离心机中以10 000 r/min速度离心3 min后获得总多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反应及测试条件测定提取液的吸光度值，多酚得率由式(1)计算得到，结果如图4所示。

图4 高剪切转速的影响

由图4可知：高剪切转速16 000 r/min时，总多酚提取量最多，达到5.68 mg/g；起初随着剪切转速的增加，香蕉皮冻果中提取的总多酚含量明显提高，在达到最大值后随着剪切速度的递增，冻果中总多酚得率显著降低，这可能是因为剪切力的增强，使得溶液温度升高加速多酚类物质氧化。因此剪切转速设为16 000 r/min。

2.1.4 剪切时间的影响

分别称取解冻后香蕉皮7 g 5份于剪切瓶中，固定液料比20∶1，加入40%乙醇溶液140 mL，剪切转速设为16 000 r/min，分别剪切1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 min，均质化完成后，使溶液静置，离心后得到总多酚的提取物。以Folin-Ciocalteu法反应及测试条件测定提取液的吸光度值，多酚得率由公式(1)计算得到，结果见图5。

图5 剪切时间的影响

图5显示：随着剪切时间的增加香蕉皮冻果中总多酚提取量随之增加，不间断剪切3 min时总多酚的得率达到最大值5.70 mg/g，延长剪切时间总多酚提取量降低。一方面高速剪切的时间越长，对植物细胞的破坏力强度越大，另一方面可能是与氧气接触的时间越多，酚类被氧化的几率也越大，从而使多酚质量分数降低，因此将剪切时间选定为3 min。

2.2 响应面优化设计测试和结果分析

2.2.1 响应面法因素水平的选择

在单因素试验结果的基础上，根据香蕉皮冻果中总多酚的提取量设计四因素三水平试验方案，见表1。

表1 响应面试验方案设计

2.2.2 响应面法试验方案及结果

以高剪切时长(X1)、剪切转速(X2)、液料比(X3)和乙醇体积分数(X4)为自变量，得率(Y)为响应值，通过中心组合试验测量30个测试点，构建响应面模型，如表2所示。

表2 响应面设计方案与结果

2.2.3 响应面方差分析

通过软件分析和方差分析的结果(表3)可知：P<0.000 1，选用的模型为极显著；失拟项P>0.05不显著，表明回归模型具有较好的拟合性；获得的测试值接近预测值，各因素与响应值之间线性关系差异系数R2为 0.981 8，调整系数R2为0.963 6，说明此模型能够用来描述香蕉皮多酚提取实验的结果；信噪比为20.853 > 4,说明该模型响应信号较强，变异系数为1.38%，表现出较好的重现性。

在上述实验中，X1、X12、X22、X32这4个因素极为显著，X2、X3、X1X2这3个因素较为显著。

表3 方差分析

2.2.4 响应面与等高线

从响应面3D图以及等高线的形状可直接找出影响实验值的最直接原因，而且可以直观描述试验中不同影响因素的强弱效果，并由响应面最大值和等高线则能够判断出植物多酚提取需要的最优工艺。

受不同变量影响及各因素之间相互作用的响应面与等高线见图6。通过响应面分析结果(图6)可知：各种因素对香蕉皮中总多酚得率的影响由大至小依次为高剪切时长(X1)、高剪切转速(X2)、料液比(X3)、乙醇体积分数(X4)；经优化后的最优条件是高剪切时长2.93 min、高剪切转速16 421.50 r/min、液料比21.17∶1(mL/g)和乙醇体积分数39.27%，预测总多酚提取得率为5.81 mg/g。

为了便于实际操作，最优工艺参数修正为：高剪切时长3 min，高剪切转速16 000 r/min，液料比20∶1(mL/g)，乙醇体积分数40%，以此条件经过3次平行试验进行方法验证，香蕉皮冻果中总多酚得率的平均值为(5.74±0.2)mg/g，接近响应面分析的预测值，表明该模型准确、可靠，能较好的优化本实验工艺。

图6 响应面与等高线

3 结论

(1)本文研究利用高剪切法辅助乙醇提取香蕉皮冻果中总多酚，经单因素实验及响应面法进行优化后获得的最优提取方法如下：液料比20∶1 mL/g，乙醇体积分数40%，高剪切转速16 000 r/min，高剪切时长3 min，香蕉皮冻果中总多酚得率的平均值为(5.74±0.2)mg/g。

(2)由高剪切辅助乙醇提取香蕉皮中总多酚耗时短，提取得率高、设备简单，能耗低，是适合于天然多酚提取的方法。