新疆番茄黄化曲叶病毒与烟粉虱隐种的区域分布检测

韩畅，张兴旺，高国龙，韩盛，都业娟*

(1 石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室，新疆 石河子 832003；2 农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/新疆农业科学院植物保护研究所，新疆 乌鲁木齐 830091)

番茄黄化曲叶病(Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)是影响番茄生产的主要病毒病害。该病害可由多种双生病毒(Geminiviruses)引起[1]，其中尤以番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)发生最广，危害最重。TYLCV侵染番茄后表现为植株矮化、叶片上卷、产量降低，苗期感染时可造成绝收。TYLCV属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，是由烟粉虱(Bemisiatabaci)传播的单链DNA病毒，共编码6个开放阅读框架(ORF)，单个基因组DNA-A就能侵染致病[2]。

烟粉虱是一个全球广泛分布的、包含30多个隐种的物种复合体[3-6]，遗传结构十分复杂。其中，入侵性很强的“B型”和“Q型”烟粉虱，分别属于Middle East-Asia Minor 1(MEAM1)隐种和Mediterranean(MED)隐种[7]，目前在许多入侵地逐渐取代本地烟粉虱[4]。王晓伟等[8]研究表明，这可能与入侵型烟粉虱分泌Bt56的能力明显强于本地烟粉虱有关，存在于烟粉虱唾液中的Bt56蛋白不仅能降低植物的抵抗力，还能增强烟粉虱的存活和繁殖力。在过去的20多年里，随着烟粉虱MEAM1和MED隐种在世界各地的爆发，TYLCV也在世界不同地区扩展发生，并造成番茄等多种作物的严重损失。我国2006年首次在上海检测到TYLCV[9]，随后几年迅速扩展至山东、北京、新疆等地[10-11]，目前已在全国31个省市番茄等寄主上发生。刘勇等[12]于2013—2017年对全国采集的6533份番茄病毒病样品进行检测，结果表明：TYLCV的检出率仅次于CMV(Cucumbermosaicvirus)、TMV(Tobaccomosaicvirus)和ToMV(Tomatomosaicvirus)，已给我国番茄生产造成了严重损失。

新疆地域广阔，天山山脉横贯中部，地理气候差异很大，通常按地理区域分为南疆、北疆和东疆。2011年底，在南疆喀什地区莎车县发现番茄黄化曲叶病毒病[13]，并迅速扩展至东疆的吐鲁番地区[14-15]，对新疆设施农业和番茄产业影响较大。近年番茄黄化曲叶病在新疆不断扩散，是否与传播介体烟粉虱的优势种群分布动态发生变化有关？本研究通过分子检测明确其在北疆、南疆(昆玉市)和东疆(鄯善县)的分布，并选取上述地点采集烟粉虱进行隐种鉴定和带毒检测，旨在明确新疆番茄黄化曲叶病的发生与烟粉虱优势种群的分布及其带毒率的相关性，从而为其有效防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

供试番茄病株：2014年1月—2018年11月从温室和露地共采集229份番茄黄化曲叶病疑似病株用于TYLCV检测，其中南疆41份、东疆38份、北疆150份(表1)，病株均表现黄化、曲叶等症状，置-70 ℃冰箱保存备用。

供试烟粉虱：从上述温室和露地番茄疑似病株上同时采集543头烟粉虱用于隐种和带毒检测，其中南疆(昆玉市)142头，东疆(鄯善县)135头，北疆(克拉玛依市、石河子市、乌鲁木齐市)266头(表1)。

表1 番茄及烟粉虱样品采集信息

1.2 供试菌株及试剂盒

E.coliDH5α菌株、用于TYLCV及烟粉虱检测的阳性对照质粒由石河子大学植物病理学教研室提供；植物DNA提取试剂盒Plant DNA Isolation Reagent购自TAKARA宝生物工程(大连)有限公司，单头烟粉DNA提取试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit DNA购自QIAGEN公司；PCR扩增Taq PCR Master Mix试剂盒，DNA纯化回收Universal DNA Purification Kit试剂盒购自TIANGEN生化科技有限公司。

1.3 用于TYCLV和烟粉虱检测的引物

特异性引物TYLCV-F/TYLCV-R[16]用于TYLCV的检测；通用引物C1-J-2195/TL2-N-2819[17]及Q-F/Q-R、B-F/B-R[18]分别用于烟粉虱及MED和MEAM1隐种的检测(表2)。

表2 用于检测TYCLV和烟粉虱的引物

1.4 番茄病株TYLCV的PCR检测

提取番茄植物总DNA(参照TAKARA公司的Plant DNA Isolation Reagent试剂盒说明)，利用TYLCV的特异性引物TYLCV-F和TYLCV-R进行PCR扩增，以实验室保存的含TYLCV基因组的质粒为阳性对照，对供试番茄病株进行TYLCV带毒检测。PCR反应体系(总体积为25 μL)为12.5 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA模板，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，加ddH2O补足25 μL。反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1～3 min，循环5次；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1～3 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。

1.5 烟粉虱MED隐种和MEAM1隐种的PCR检测

提取单头烟粉虱总DNA(参考QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit DNA试剂盒说明)，利用烟粉虱通用引物C1-J-2195和TL2-N-2819进行PCR扩增，对烟粉虱进行种类鉴定；确定为烟粉虱的样品再分别利用MED隐种的特异性引物Q-F和Q-R、MEAM1隐种的特异引物B-F和B-R进行扩增，以实验室保存的质粒为阳性对照，对烟粉虱隐种进行检测。PCR反应体系同1.4。利用烟粉虱通用引物进行PCR扩增反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。利用隐种特异引物进行PCR扩增的反应程序是：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果并回收纯化目标条带。

1.6 烟粉虱携带TYLCV的PCR检测

对上述检测为不同隐种的烟粉虱再利用TYLCV的特异性引物TYLCV-F和TYLCV-R分别进行带毒检测。以实验室保存的含TYLCV基因组的质粒为阳性对照。PCR 反应体系及反应程序同1.4。

2 结果与分析

2.1 番茄黄化曲叶病病株症状

新疆温室及露地番茄上发生的黄化曲叶病的症状主要表现为：植株节间变短，矮化(图1 A)；叶片变小、变厚，质感脆硬并向上卷曲、黄化，部分品种后期叶脉呈紫色(图1B)；苗期受害则花少或不开花，全株坐果很少，果实小而畸形，严重时不结果(图1C、D)。

A—苗期危害状；B—叶脉变紫；C—温室番茄受害症状；D—TYLCV危害症状。图1 番茄黄化曲叶病症状

2.2 番茄TYLCV带毒率的分子检测

利用TYLCV的特异性引物TYLCV-F和TYLCV-R对采集自新疆不同区域的229份番茄样品进行PCR扩增，170份样品扩增到与阳性对照一致的540 bp的目标片段(图2)，表明这些番茄样品受到TYLCV侵染，带毒率达74.2%。

M—DNA分子量标准；1—阳性性对照；2—阴性对照；3～23为番茄样品。图2 TYLCV-F/TYLCV-R引物对不同番茄样品的PCR检测

温室采集的129份样品中，107份检测到病毒，带毒率为82.9%。其中采集自南疆昆玉市温室41份样品均检测到病毒，带毒率为100%；采集自东疆鄯善县温室38份样品，18份检测到病毒，带毒率为47.4%；采集自北疆克拉玛依市温室50份样品中，48份带毒，带毒率高达96%(表3)。

露地采集的100份样品中，63份检测到病毒，带毒率为63.0%。其中采集自克拉玛依的90份样品60份检测到病毒，带毒率66.7%；采集自乌鲁木齐露地的3份样品均检测到病毒，带毒率100%；采集自石河子露地的7份番茄均未检测到病毒(表3)。

表3 新疆番茄TYLCV的带毒率检测

2.3 烟粉虱隐种的鉴定

利用烟粉虱mtDNA COI基因片段通用引物C1-J-2195和L2-N-3014，对采集自新疆不同区域的543头粉虱的DNA分别进行PCR扩增，结果显示，543头粉虱均扩增到与阳性对照一致的约840 bp的目标条带(图3)，表明这些粉虱均为烟粉虱(Bemisiatabaci)；进一步利用MED隐种特异性引物Q-F和Q-R，MEAM1隐种的特异引物B-F和B-R分别对543头烟粉虱进行隐种检测，结果显示，449头可由引物Q-F和Q-R扩增到约300 bp的目标条带，却不能由引物B-F和B-R扩增到任何目标条带，表明449头烟粉虱为MED隐种，占供试烟粉虱的82.7%；94头烟粉虱可由引物B-F和B-R扩增到约480 bp的目标条带，不能由引物Q-F和Q-R扩增到任何目标条带，表明这94头烟粉虱为MEAM1隐种，占供试烟粉虱的17.3%(图4)。

M—DNA分子量标准；1—阴性对照；2—阳性对照；3～8为烟粉虱样品。图3 基于mt DNA COI基因的烟粉虱检测

M—DNA分子量标准；1、2为MEAM1和MED隐种阳性对照；3、4为MEAM1和MED隐种阴性对照；5～24为烟粉虱样品。图4 烟粉虱MED和MEAM1隐种的PCR检测

从烟粉虱来源看，温室采集的397头烟粉虱中，375头为MED隐种，占94.5%；22头为MEAM1隐种，占5.5%。其中，南疆昆玉市采集的142头烟粉虱中，141头为MED隐种，占99.3%，1头为MEAM1隐种，占0.7%；东疆鄯善县采集的135头烟粉虱中，116头为MED隐种，占85.9%，19头为MEAM1隐种，占14.1%；北疆(克拉玛依市)采集120头，118头为MED隐种，占98.3%，2头为MEAM1隐种，占1.7%(表4)。表明，新疆温室番茄上的烟粉虱虽有MEAM1隐种发生，但是主要以MED隐种为优势隐种。露地采集的146头烟粉虱中，74头为MED隐种，占50.7%，72头为MEAM1隐种，占49.3%。其中克拉玛依市采集的54头、乌鲁木齐市采集的20头烟粉虱，均为MED隐种；石河子市采集的72头烟粉虱，均为MEAM1隐种(表4)。表明北疆露地番茄上的烟粉虱的优势隐种在不同地区之间存在明显差异。

2.4 烟粉虱TYLCV带毒率的分子检测

利用TYLCV特异性引物TYLCV-F和TYLCV-R，对所有烟粉虱带毒率进行检测。结果显示，从2个隐种的烟粉虱上均能扩增到与阳性对照一致的540 bp的目标片段(图5)，表明烟粉虱的2个隐种均能携带TYLCV。对不同隐种的带毒率的统计结果显示，449头MED隐种中，273头检测到病毒，带毒率为60.8%；94头MEAM1隐种中，4头检测到病毒，带毒率为4.3%，表明MED隐种带毒率远远高于MEAM1隐种的带毒率。

M—DNA分子量标准；1—阴性对照；2～5为MED隐种烟粉虱；6～8为MEAM1隐种烟粉。图5 TYLCV-F/TYLCV-R引物对烟粉虱的PCR检测

对烟粉虱带毒情况的分析结果显示，温室采集的375头MED隐种中，236头检测到病毒，带毒率62.9%；22头MEAM1隐种中，4头检测到病毒，带毒率18.2%。其中南疆昆玉市采集的141头MED隐种中，108头检测到病毒，带毒率76.6%，MEAM1隐种1头带毒，带毒率100%；东疆鄯善县采集的116头MED隐种中，80头检测到病毒，带毒率为68.9%，19头MEAM1隐种中，3头检测到病毒，带毒率15.8%；北疆克拉玛依市采集的118头MED隐种中，48头检测到病毒，带毒率为40.7%，2头MEAM1隐种未检测到病毒。结果表明，温室中发生的烟粉虱，2个隐种都能传播TYLCV，但主要以MED隐种传播为主。

露地采集的74头MED隐种烟粉虱中，37头检测到病毒，带毒率50.0%；72头MEAM1隐种均未检测到病毒，带毒率为0。其中北疆克拉玛依市54头MED隐种中，31头检测到病毒，带毒率为57.4%；乌鲁木齐市20头MED隐种中，6头检测到病毒，带毒率30.0%；石河子市采集的72头MEAM1隐种均不带毒(表5)。结果表明，露地番茄上发生的TYLCV是由MED隐种携带传播的。

表5 烟粉虱隐种携带TYLCV的分子检测

3 讨论

TYLCV引起的番茄黄化曲叶病对新疆番茄种植业产生严重危害，本研究针对新疆不同区域采集的229份疑似番茄黄化曲叶病株进行TYLCV的PCR检测，结果表明带毒率为74.2%。其中，来源于温室和露地的番茄样品，TYLCV带毒率分别为82.9%、63.0%，说明TYLCV在新疆温室和露地栽培的番茄上均可发生危害。

烟粉虱是TYLCV唯一传播介体，研究[4,8]表明其入侵隐种MED和MEAM1比土著烟粉虱具有更强的生存和繁殖能力，且MED隐种正逐步取代MEAM1隐种，成为优势种群。段晓东等[19]2011年首次报道MED隐种烟粉虱入侵新疆。为明确新疆烟粉虱入侵隐种MED和MEAM1的分布，本研究对采集自不同区域番茄上的543头烟粉虱进行检测，结果显示MED隐种和MEAM1隐种的检出率分别为82.7%、17.3%，表明MED隐种已成为新疆烟粉虱优势种群。其中温室采集的397头烟粉虱中，MED和MEAM1隐种分别占94.5%、5.5%，说明MED隐种烟粉虱已成为温室烟粉虱优势种群；露地采集的146头烟粉虱中，来源于乌鲁木齐市和克拉玛依市的74头均为MED隐种，来源于石河子市的72头均为MEAM1隐种，说明露地环境中不同区域烟粉虱优势种群存在明显差异。本研究对新疆烟粉虱隐种分布的检测与此前报道存在一定差异，表明新疆不同区域烟粉虱种群组成呈动态变化：曹骞等[13]2013年报道和田地区烟粉虱种群仅MEAM1隐种，但本研究表明MED隐种已扩散至和田地区，且在和田昆玉市已成为优势种群；本研究中东疆鄯善县和北疆克拉玛依市烟粉虱为MED隐种和MEAM1隐种混合发生，但以MED隐种为主，曹骞等在上述两区域仅检测到MED隐种；乌鲁木齐市烟粉虱仅检测到MED隐种，石河子市烟粉虱仅检测到MEAM1隐种，与曹骞报道一致。

TYLCV近年在全球蔓延危害，不仅由于MED隐种扩展迅速，更因MED隐种烟粉虱携带TYLCV的能力和传毒效率显著高于MEMA1隐种[20]。本研究检测结果表明，MED和MEAM1隐种均可携带病毒，MED隐种带毒率为60.8%，远远高于MEAM1隐种4.3%的带毒率。其中，温室和露地采集的MED隐种烟粉虱带毒率分别为62.9%、50.0%，MEAM1隐种烟粉虱带毒率分别为18.2%和0，说明MED隐种烟粉虱是温室和露地番茄TYLCV的主要带毒介体。石河子市番茄上的72头烟粉虱均为MEAM1隐种，且未检测到TYLCV，而该区域番茄上也未检测到TYLCV的侵染，进一步说明新疆番茄TYLCV主要由MED隐种携带并进行传播。

本研究中克拉玛依市采集的90株番茄样品包括2015年7月采集的40株和同年9月采集的50株，经检测2次样品中TYLCV的带毒率由42.5%上升至86.0%，表明番茄植株带毒率随其生长时间延长呈明显上升趋势。调查时田间可见大量烟粉虱，所采集的54头烟粉虱经检测均为MED隐种，其带毒率达到57.4%，说明MED隐种烟粉虱可在露地番茄生长过程中，持续有效传播病毒并发生危害。

随着研究的开展，人们对TYLCV传播途径的认识也不断深入。2016年首次报道了TYLCV可以通过番茄种子进行传播[21]，新疆番茄黄化曲叶病的爆发危害与TYLCV随番茄种子的调运不断进入新疆是否有关有待进一步研究。2017年报道了烟粉虱可以经卵传播TYLCV[22]，打破了过去认为该病毒不能通过烟粉虱卵进行传播的认识，新传播途径的明确对TYLCV的防治不断提出考验和思路。