茶多酚对急性镉（Ⅱ）暴露小鼠红细胞及肝脏损伤的拮抗作用

汪雪睿 黄保嘉 李 想， 王 硕 程 代，*

（1 天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室 天津 300457 2 南开大学医学院 天津 300071）

镉是一种广泛分布于环境中的重金属元素，会通过自然界的富集作用逐渐以食源性途径进入人体[1-2]。镉污染引起的“痛痛病”爆发后，镉的生物毒性受到世界广泛关注。世卫组织在食品污染毒性报告中指出，镉是排名第三的食品污染物，仅次于黄曲霉毒素和砷[3]。国际癌症研究委员会（IARC）也将镉列为IA 类致癌物[4]。研究表明，人体中的镉主要在肺和消化道中被吸收，生物半衰期长达10～40 年，吸收后的镉会主要蓄积在生物体的肝脏和肾脏部位，从而引发脏器功能损伤、生殖系统损伤、心血管疾病、骨质疏松症和癌症等疾病[5]。镉的毒性主要归结于其对机体氧化还原体系及离子稳态的破坏，镉会增强细胞膜结构上发生的脂质过氧化作用，对机体产生氧化胁迫损伤细胞结构，并抑制机体内过氧化物酶的活性，进一步加重机体氧化损伤[6]。

茶多酚（Tea polyphenols，TP），是从茶叶中提取出的多羟基酚类化合物[7-8]。大量研究表明，茶多酚具有抗氧化，免疫调节，抗肿瘤，抗菌，预防动脉硬化等多种生物保健功能[8-10]。茶多酚可直接作用于自由基或与自由基相关的酶，与诱导产生氧化作用的金属离子络合，从而发挥生物活性[8]。路宏朝等[11]研究表明，茶多酚可显著降低酒精性肝损伤的大鼠肝脏中ROS 浓度。马兰萍等[12]研究表明茶多酚可以抑制红细胞膜上发生的脂质过氧化，防止红细胞溶血。

本文采用腹腔注射CdCl2溶液的方式建立急性染镉小鼠模型，通过小鼠血红细胞脆性和形态学观察以及肝脏和血液中Cd 元素含量检测，结合肝脏氧化应激水平的变化和肝脏病理学观察，评估镉对小鼠肝脏及血液结构和功能的影响，以及茶多酚对急性镉暴露引起的肝脏和血液毒性的预防效果。对于后续利用茶多酚等植物多酚提取物，以食源性方式预防和改善镉中毒具有一定的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

32 只8 周龄雄性昆明小鼠，体重30～35 g。实验用批准号为SCXK（2007-2004），由北京斯贝福生物有限公司提供。

1.2 材料与试剂

茶多酚（纯度98%）、肝素钠、PBS 缓冲液，北京索莱宝科技有限公司；CdCl2（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；结晶紫（纯度98%），天津市百世化工有限公司；戊二醛（纯度50%），欧博特化工贸易有限公司。

1.3 试验仪器

电子天平，奥豪斯公司；pH 计，梅特勒托利多公司；微波消解仪，培安；Thermo 991 超低温冰箱、MK-3 型酶标仪、SP131320-33 磁力搅拌器，赛默飞世尔科技；MX-E 混匀器，赛洛捷克；紫外可见分光光度计，德国Eppendorf 公司；电感耦合等离子体质谱，德国赛默飞世尔公司。

1.4 试验方法

1.4.1 实验动物分组 32 只昆明小鼠适应性饲养7 d 后随机分为4 组，分别为空白对照组、染镉模型组、茶多酚保护组和茶多酚对照组，每组8只，自由采食和饮水，饲养5 d。饲养条件：室温（22±2）℃，相对湿度（45±3）%，12 h 光照/黑暗连续循环。

1.4.2 给药剂量与方法 按照上述分组，以腹腔注射的形式给药。空白对照组：0.9%NaCl；Cd：单次腹腔注射CdCl2（0.5 mg/mL）于小鼠；Cd+TP 组：单次腹腔注射CdCl2（0.5 mg/mL）于小鼠，后续用TP（100 mg/kg）腹腔注射5 d 进行干预；TP 组：连续5 d 小鼠腹腔注射茶多酚（100 mg/kg）。

腹腔注射结束后，各组小鼠禁食（饮水自由）24 h，麻醉小鼠，由股动脉取血，解剖摘取肝脏，所有样品及时置于-80 ℃保存备用。

1.4.3 生化指标测定

1.4.3.1 红细胞的渗透脆性曲线 通过不同质量分数的氯化钠（NaCl）溶液测定小鼠红细胞渗透脆性，在540 nm 波长处测量上清的OD 值。空白对照作溶血100%，绘制红细胞渗透脆性曲线。

1.4.3.2 红细胞的形态学观察 用0.5%结晶紫对各组红细胞的海恩兹小体进行检测，将细胞固定在玻片上，在光学显微镜下观察红细胞形态（放大100 倍）。

用1%戊二醛固定各组红细胞悬液，乙醇分级脱水。室温下自然干燥，制片后样品喷涂金属膜，在扫描电子显微镜（SEM）下观察红细胞形态。

1.4.3.3 血液及肝脏中镉含量测定 分别称取0.1 g 全血和0.2 g 剪碎的小鼠肝脏进行微波消解。使用电感耦合等离子体质谱检测样品溶液，得到肝脏及血液中的镉含量（mg/kg）。

1.4.3.4 肝脏组织生理生化指标的测定 取小鼠肝脏制成10%组织匀浆液，采用相关试剂盒测定匀浆液中丙二醛（MDA）含量、过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.4.3.5 小鼠血清内谷草转氨酶（AST/GOP）和谷丙转氨酶（ALT/GPT）的活性测定 采用试剂盒方法并参考相关文献测定[13]。酶活性以每分钟每毫升血清催化产生的丙酮酸表示，单位为nmol/（min·mL）。

1.4.3.6 肝脏组织病理学观察 肝脏组织用福尔马林溶液固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（厚度5 μm），经二甲苯脱蜡-乙醇复水-细胞核苏木精染色-氨水返蓝-伊红染液细胞质染色-酒精脱水并干燥-树胶封固的步骤后，在显微镜下观察组织病理学状况。

1.4.4 统计学分析 试验数据均以Mean±SD 表示，运用SPSS Statistics 18.0 进行数据统计分析。P＜0.05 为差异具有显著性，P＜0.01 为差异具有极显著性。

2 结果与分析

2.1 茶多酚对急性镉暴露小鼠红细胞渗透脆性的影响

红细胞渗透脆性与细胞的比表面积和形变能力以及细胞内氧自由基数目及各种酶活有关。由图1 可知，当氯化钠质量分数逐渐减小时，尤其当质量分数在0.4%～0.5%范围之间，红细胞溶血率发生突变。染镉模型组较空白组脆性变大，溶血率升高，表明红细胞损伤严重。茶多酚保护组较染镉模型组溶血率降低，脆性减小，表明茶多酚减弱了由镉诱导红细胞脆性增大导致的破裂损伤，茶多酚对照组红细胞溶血率较空白组而言没有显著性改变。

2.2 茶多酚对急性镉暴露小鼠红细胞形态的影响

由图2 可得，空白组（A）与茶多酚对照组（D）的红细胞形态正常、无损伤，呈现正常的凹陷形圆盘状。而染镉模型组（B）可以观察到红细胞膜表面出现黑色小点，即海恩兹小体（图中红色圆圈标记），说明镉暴露下使红细胞产生了氧化损伤，血红蛋白变性后聚集；扫描电子显微镜显示大量红细胞失去正常形状，表面有针状突起，变得不规则。茶多酚保护组（C）则较损伤组（B）海恩兹小体和棘形红细胞数量明显减少，表明茶多酚可以减轻镉诱导的红细胞损伤情况。

图1 茶多酚对急性镉暴露下小鼠红细胞渗透脆性的影响Fig.1 Effect of tea polyphenols on erythrocyte osmotic fragility in mice exposed to acute cadmium

2.3 茶多酚对急性镉暴露小鼠血液及肝脏中镉含量的影响

由图3 可得，染镉模型组同空白对照组相比，血液和肝脏中镉含量显著升高，表明镉在血液循环的影响下向其它组织传递。与染镉模型组相比较，茶多酚保护组的镉含量显著降低，说明茶多酚能减少镉在血液及肝脏中的积累。两个对照组结果未显现出明显的差异。

2.4 茶多酚对急性镉暴露小鼠血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的影响

当肝脏发生病变时，AST 和ALT 会释放入血，血清中的AST 和ALT 活性会随着肝脏损伤加重而升高。故血清中的AST 和ALT 酶活可作为检测肝功能的指标。由图4 可知，染镉模型组的AST及ALT 活性较空白对照组有极明显的升高趋势，表明肝脏细胞在镉暴露下有损伤甚至病变情况产生。茶多酚保护组相比染镉模型组谷草转氨酶活性降低了15.3%；谷丙转氨酶活性降低了12.1%，说明茶多酚能够减轻镉对小鼠肝脏的损伤作用。两个对照组AST 及ALT 活性基本无差异，表示茶多酚对肝脏无明显伤害。

图3 茶多酚对急性镉暴露小鼠血液及肝脏中镉含量的影响Fig.3 Effect of tea polyphenols on cadmium content in blood and liver of mice exposed to acute cadmium

图4 茶多酚对急性镉暴露小鼠血清中谷草转氨酶（a）和谷丙转氨酶（b）活性的影响Fig.4 Effect of tea polyphenols on the activities of aspartate aminotransferase（a）and alanine aminotransferase（b）in serum of mice exposed to acute cadmium

2.5 茶多酚对急性镉暴露小鼠肝脏抗氧化指标的影响

超氧化物歧化酶（SOD）具有清除机体内产生的氧自由基的功能。通过检测器官SOD 水平，可以评价器官功能以及其所受的氧化损伤程度等指标。过氧化氢酶（CAT）是机体内氧化还原体系的重要组成酶，广泛存在于各个组织器官中，特别在肝脏中的浓度较高，负责及时分解由机体代谢产生的H2O2，保证机体免受氧化损伤。当器官内部过氧化氢酶较低时，表明组织对机体内部氧化损伤的应对能力较弱。结果显示，染镉模型组较空白对照组的CAT 及SOD 活力下降，说明镉显著减弱小鼠肝脏的抗氧化能力。茶多酚保护组较损伤组CAT 活性显著升高49.5%；SOD 活性升高16.2%，表明茶多酚能降低镉引起的酶活性减弱，并且能在一定程度上提高肝的抗氧化性。

在小鼠肝脏组织中，丙二醛（MDA）是由自由基（ROS）与脂质发生一系列氧化反应产生的。因此，可根据组织中丙二醛含量推测肝脏过氧化程度。由图5 可知，急性染镉后肝脏中丙二醛的含量显著高于空白对照组，这表明镉导致肝细胞损伤，促进脂质过氧化。茶多酚保护组较染镉组丙二醛含量下降28.0%，说明茶多酚对镉引起的过氧化反应具有较好的保护作用。

图5 茶多酚对急性镉暴露小鼠肝脏SOD 活性（a）、CAT 活性（b）和MDA 含量（c）的影响Fig.5 Effect of tea polyphenols on SOD activity（a），CAT activity（b）and MDA content（c）in mice exposed to acute cadmium

2.6 茶多酚对急性镉暴露小鼠肝脏组织的影响

由图6 可见，空白对照组（a）中有较为完整的肝小叶组织，包含正常状态的中央静脉（CV）、肝血窦（黑色箭头）和围绕静脉分布、排列有序的肝索细胞（E）；而镉暴露组（b）中，肝脏组织有较为明显的损伤情况，表现为血管堵塞（F），部分组织细胞空泡样变性（圆圈），同时中央静脉中有一定的细胞脱落现象（黑色箭头）；茶多酚保护组（c）中，只有少量组织出现轻微增生或变性现象（圆圈），其它部分并未表现出异常，损伤程度较染镉组有所缓解；茶多酚对照组中（d），肝脏组织细胞形态正常，并未表现出病理现象。

3 讨论

镉作为当代使用广泛的重金属之一，对工业产生巨大效益的同时，其对环境和人体健康的伤害也越来越明显。机体中的镉会对组织细胞产生较大的氧化损伤，诱导组织产生活性氧簇（ROS），氧化细胞膜结构产生脂质过氧化反应造成器官应对氧化胁迫的能力降低[14]。在镉暴露下，机体各个器官都会受到不同程度的影响，其中肝脏受到的影响最为严重[15]。酚类化合物富含-OH 基团，具有抗氧化和螯合金属离子的特性，大量研究表明，植物酚类物质对氧化应激具有较强的调节作用。寻找有效预防和治疗镉中毒的植物酚类化合物是现代毒理学研究的主要方向之一[16]。已有研究证实类黄酮、花青素等植物酚类成分可以通过诱导抗氧化物酶，降低脂质过氧化水平等途径，保护镉诱导的机体损伤[17]。茶多酚作为一种优良的天然抗氧化剂，有大量试验研究证实其具有抗肿瘤、抗衰老和调血脂等多种药理活性，与茶多酚的抗氧化特性有密切关系[18]。本试验采用腹腔注射的方法，对雄性成年小鼠造成镉暴露，同时通过腹腔注射茶多酚对其进行保护，以评价茶多酚这种植物活性成分对缓解镉造成的血液及肝脏损伤的保护作用。

图6 茶多酚对急性镉暴露小鼠肝脏组织的影响（200 倍）Fig.6 Effect of tea polyphenols on liver tissue in mice exposed to acute cadmium（200 times）

血液数据结果显示，急性镉暴露小鼠红细胞的渗透脆性显著升高，红细胞表面产生海恩兹小体，表面呈刺状突起，形态发生改变。镉暴露小鼠血清中AST、ALT 两种转氨酶含量显著增高。镉暴露小鼠肝脏组织中脂质过氧化产物（MDA）含量明显高于空白对照组，且差异显著；抗氧化酶SOD、CAT 活性显著低于空白对照组。与模型组相比，茶多酚保护组可以不同程度减轻由镉暴露引起的抗氧化酶活的变化，并可减少MDA 含量的增加量，能有效降低血液和肝脏内镉的富集和蓄积，减轻镉导致的肝脏损伤。结合本试验结果，可以清楚的了解到急性镉暴露下，对小鼠血液及肝脏功能有一定的损害，对机体氧化还原体系产生了较大的影响，同时扰乱了机体正常的代谢过程，而茶多酚可以有效缓解以上由镉暴露引起的不良反应，减轻镉对小鼠血液及肝脏的损伤。表明茶多酚作为广泛存在的抗氧化活性物质，对镉造成的机体损伤有缓解作用，且基本不会对机体造成损害，在抗氧化，缓解重金属毒性，辅助治疗血液及肝脏损伤方面有较大的应用前景。