黄金芽茶鲜叶加工过程中色泽变化及内在原因分析

曹青青 陈根生 许勇泉* 尹军峰

（1 中国农业科学院茶叶研究所 国家茶产业工程技术研究中心 杭州 310008 2 中国农业科学院研究生院 北京 100081）

黄金芽是特殊的光照敏感型、黄色系白化茶树品种[1]，相较于普通的茶树栽培种，其叶绿体和类囊体膜结构遭到破坏，使得叶绿素合成受阻，从而鲜叶外观色泽表现为嫩黄且色彩饱和度低[2]。此外，与其它白化茶树品种一样，其鲜叶中内含物质组成也较为特殊，氨基酸含量尤其高，可高达7%～10%（占干物质重），是正常茶鲜叶的2～3 倍，以致其茶汤入口鲜爽，更容易受消费者喜欢[3-5]。黄金芽独特的外观色泽与内在品质使得它一直以来深受广大茶叶消费者的青睐与茶叶研究者的关注。

黄金芽品种鲜叶在实际生产中，绝大多数用于加工绿茶。绿茶典型的“三绿”特征中的“外形绿”主要由脂溶性色素呈现，包括叶绿素类和类胡萝卜素类化合物，前者主要由叶绿素a/b 构成，决定绿茶的绿色度；后者包括β-胡萝卜素和叶黄素，对绿茶的黄色度起主导作用[6]。绿茶在加工过程中，脂溶性色素会发生剧烈生化反应，其中叶绿素主要参与脱镁反应、脱植基反应以及氧化降解反应[7-8]。肖伟祥等[7]报道在茶鲜叶贮存或摊放过程中，一方面叶绿素酶会催化叶绿素发生脱植基反应生成叶绿素酸酯；另一方面叶绿素还会从叶绿体中解离出来，而游离态的叶绿素易被光热环境氧化，生成无色小分子物质，从而叶色变浅。类胡萝卜素在绿茶加工过程中主要发生非酶促（光、热）氧化降解[9]，生成绿茶主要香气物质，如β-紫罗酮、二氢猕猴桃内酯、橙花醇等[10]。此外，β-胡萝卜素的降解产物还有利于茶黄素和茶红素的形成，对干茶外观的红亮色泽有影响，这一点在红茶加工过程中表现得尤其明显。

初步研究发现，嫩黄的黄金芽鲜叶在杀青过程中，受热后颜色发生显著变化，呈现鲜绿色，致成品绿茶色泽与其它品种嫩度较高的鲜叶加工而成的干茶并无太大区别。这样一来，黄金芽鲜叶嫩黄的外观色泽优势无法得到凸显，严重有碍于其外观品质和商业价值呈现，而相关研究寥寥无几。本研究以此为切入点，选择较为常见的普通（未黄化）茶树品种——鸠坑作为对照，研究黄金芽鲜叶在受热以及后续绿茶加工和闷黄工序中的色泽变化规律，深入挖掘色泽变化的机理，以期能为此类白化茶树品种鲜叶的生产加工提供一定理论指导，使其色泽特殊性发挥最大优势。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄金芽和鸠坑鲜叶原料均为一芽二叶，于2017 年4 月份采摘于宜兴太华镇胥锦茶场。

叶黄素（分析纯）、叶绿素b[HPLC（≥90%）]、β-胡萝卜素[HPLC（≥95%）]等色素标品，美国Sigma 公司；叶绿素a[HPLC（≥90%）]、脱镁叶绿素a[HPLC（≥90%）]、脱镁叶绿素b[HPLC（≥90%）]等色素标品，日本WAKO 公司；乙腈、乙酸、氯仿、甲醇均为色谱纯级；乙醇、丙酮为分析纯级；纯水，杭州娃哈哈集团。

1.2 仪器与设备

X3-233A 微波炉，广东美的厨房电器制造有限公司；80 型滚筒杀青机，富阳茶叶机械总厂；茶叶多功能理条机，浙江恒峰科技开发有限公司；FTS-13TD 型冷冻干燥机，美国KINETICS 公司；CM-600d 型手持式分光测色仪，柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；Eppendorf 台式高速大容量离心机5810R，德国艾本德股份公司；ACQUITY UPLC H-Class 色谱系统，Waters 科技（上海）有限公司；研钵。

1.3 试验方法

1.3.1 茶叶样品制备 采摘后的鲜叶室温摊放12 h 后，分别制备样品，具体操作步骤如下：

1）鲜叶样品 取样后的鲜叶液氮罐低温保存48 h，随后真空冷冻干燥。

2）鲜叶加热处理样品 取样后的鲜叶进行微波加热，微波炉高火（900 W）加热30 s，取出摊晾至室温（该过程重复3 次），最终待冷却至室温后放入液氮罐低温保存48 h，随后与鲜叶一起真空冷冻干燥。

3）未闷黄处理样品 摊放12 h 后的鲜叶按绿茶加工工艺：杀青—轻揉捻—烘干制备成绿茶样。

4）闷黄处理样品 摊放12 h 后的鲜叶按黄茶加工工艺：杀青—45 ℃闷黄3 h—轻揉捻—烘干制备成黄茶样。

1.3.2 色差测定 采用L*a*b 色差系统直接测定干茶色差，每次取样前用手持式分光测色仪任取6 点测定即时色差，其中L*值代表亮度；a*代表红绿色度，“+”表示红色，“-”表示绿色；b*代表黄蓝色度，“+”表示黄色，“-”表示蓝色；h°代表色度角。

1.3.3 色素测定

1）标准品配制 叶黄素、叶绿素a/b、脱镁叶绿素a/b 以及β-胡萝卜素共6 种色素标准品，首先均用乙醇配制成0.1 mg/mL 的母液备用，然后继续用乙醇稀释100 倍后上机使用。

2）样品前处理 称取各茶叶样品约0.500 g（精确记录数值备用），弱光环境下加适量石英砂研磨成粉末，每次加5 mL 80%冰丙酮（配制80%丙酮水溶液于4 ℃冰箱静置过夜后使用，使用过程中冰浴处理）水溶液避光提取2 h，然后5 000 r/min 离心10 min 转移上清液于25 mL 棕色容量瓶，提取过程可重复5 次直到茶渣完全泛白，提取过程中以避光静置为主，0.5 h/次间隔辅助人工振荡效果较佳，最终用80%冰丙酮定容后获得色素提取液。色素提取液经0.22 μm 有机膜过滤后方可进样检测。

3）色谱条件 采用Waters 的ACQUITY UPLC H-Class 色谱系统，色谱方法参考潘顺顺等[11]优化改动后如下。色谱柱：Acquity UPLC HSS T3 柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温：35 ℃；流速：0.413 mL/min；检测波长：210～600 nm 全扫；流动相A 为3∶0.5∶96.5（体积比）的乙腈、乙酸和水的混合液，流动相B 为75∶15∶10（体积比）的乙腈、甲醇和氯仿混合液。洗脱梯度如表1 所示。

表1 UPLC 流动相洗脱梯度Table 1 UPLC elution programs

1.3.4 数据分析 各试验数据均以平均值±标准差（Means±SD）表示，数据基础分析采用Microsoft Excel 2016；作图采用GraphPad Prism 7.00；t 检验、单因素方差分析及LSD 多重比较均采用SAS 9.4。

2 结果与分析

2.1 UPLC 脂溶性色素分离方法的确定

茶叶样品中包括叶黄素、叶绿素a/b、脱镁叶绿素a/b 以及β-胡萝卜素等的6 种脂溶性色素含量测定参考潘顺顺等[11]的HPLC 色素分析方法。保留原始流动相成分，即以3∶0.5∶96.5（体积比）的乙腈、乙酸和水的混合液为流动相A，以75∶15∶10（体积比）的乙腈、甲醇和氯仿混合液为流动相B，在此基础之上优化转换成UPLC 法。使用Acquity UPLC HSS T3 柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），柱温35 ℃，流速0.413 mL/min，线性洗脱梯度如表1 所示。在该色谱条件下，6 种色素的分离效果与效率明显提高（图1），原方法40 min 的洗脱任务现12 min 内能完成，6 种色素：叶黄素、叶绿素b、叶绿素a、脱镁叶绿素b、脱镁叶绿素a 以及β-胡萝卜素的保留时间分别为2.163，3.452，6.328，7.221，7.770，9.043 min。

图1 UPLC 色素洗脱效果图Fig.1 Pigments separation in UPLC

2.2 黄金芽与鸠坑品种的色泽区别

黄金芽与鸠坑品种的鲜叶以及后续各加工过程的成品茶外观色泽均差异显著（图2）。黄金芽品种鲜叶制备的各样品L*/a*/b*值普遍高于鸠坑组样品（图3a～3d），说明黄金芽组样品光泽度较好，亮度高，色彩上黄色度更高。其中，a*值随处理或加工方式不同变动最大，鲜叶状态下的黄金芽a*值（2.312±1.691）为正值而鸠坑（-4.606±1.327）为负值，微波加热后鸠坑（-3.593±0.821）值略有增大，而黄金芽（-3.166±0.743）则从正值锐减至负值甚至与鸠坑之间无显著差异（P＞0.05），未闷黄处理组样品依然呈现一正一负，而闷黄处理后二者都显著增大并均呈正值（黄金芽2.222±0.390，鸠坑1.662±0.288）。对应图2 的视觉效果，鲜叶状态下嫩黄色的黄金芽和绿色的鸠坑，加热后变为鲜绿色的黄金芽和较为暗绿的鸠坑，未闷黄处理为黄绿色的黄金芽和深绿色的鸠坑，以及闷黄处理后二者均呈现的以黄色为主的色调。整体来说，微波加热及未闷黄处理均会导致黄金芽颜色变绿而鸠坑颜色变黄。

图2 黄金芽与鸠坑品种鲜叶及干茶图片Fig.2 The pictures of tea samples made from Huangjinya and Jiukeng cultivars

图3 黄金芽与鸠坑品种鲜叶及干茶色差Fig.3 The chromatism of tea samples made from Huangjinya and Jiukeng cultivars

这些表观色泽的变化现象可以追溯到其内含色素成分的变化。UPLC 的色素数据结果（图4）显示，从鲜叶到干茶的各个环节中，黄金芽品种叶片的各色素含量均显著低于鸠坑品种（图4a～4d），包括叶黄素、叶绿素a/b、脱镁叶绿素a/b 以及β-胡萝卜素。这与Wang 等[12]的研究结果相似，他们发现同样是白化茶树品种的中黄2 号鲜叶的各色素（包括叶绿素a/b、叶黄素和β-胡萝卜素）含量水平均显著低于常规茶树品种的龙井43 号。Feng等[13]报道黄金芽、天台黄、郁金香等白化茶树品种中叶绿素a/b、叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄素以及堇菜黄素的含量都显著低于福鼎大白茶。因为这些白化茶树品种受外界因素或是自身遗传因素的影响，导致叶绿体结构受损、叶绿素合成受阻，以致其色素含量组成较为特殊[14]。此外，黄金芽和鸠坑品种鲜叶中均含有微量脱镁叶绿素a（黄金芽1.973 mg/100 g，鸠坑26.322 mg/100 g），而未检测到脱镁叶绿素b 的存在（图4a）。这可能与本研究中的鲜叶处理有关，由于在鲜叶室温摊放过夜后取样，而鲜叶在摊放贮存过程中已经开始内含物质的转化了，包括叶绿素的降解。叶绿素降解时，叶绿素b 会先转化成叶绿素a 而后再进行降解[15]，进而生成脱镁叶绿素、脱植基叶绿素等，因此导致研究中出现的黄金芽与鸠坑鲜叶中均存在少量脱镁叶绿素a 而无脱镁叶绿素b 的结果。

根据绿色素和黄色素组分的相对含量（图4e～4h），发现黄金芽品种的叶片中叶黄素、β-胡萝卜素等黄色素组分相对含量远远高于鸠坑种，而叶绿素a/b 和脱镁叶绿素a/b 等绿色素总量恰恰相反。这或许就是黄金芽品种鲜叶以及后续各工序样品的外观看起来要比鸠坑种普遍偏黄，且色彩饱和度偏低的原因所在。

图4 黄金芽与鸠坑品种鲜叶及干茶的色素含量Fig.4 The pigments content of tea samples made from Huangjinya and Jiukeng cultivars

2.3 加热对鲜叶色泽的影响

黄金芽鲜叶微波加热处理后，外观色泽由嫩黄色蜕变成鲜绿色（图2a 和2b），正如图5a 显示，加热可使鲜叶色差参数a*由正（2.312）转负（-3.166），色度角h°显著升高（P＜0.0001）。而鸠坑品种鲜叶加热后，外观色泽除了亮度降低（P＜0.001）外并无显著变化，整体色泽依然是绿色。结果表明，鸠坑品种鲜叶的色泽热稳定性更高。

图5 加热处理对鲜叶色差的影响Fig.5 The effect of thermal treatment on chromatism of tea samples

图6 中显示的色素含量数据结果有所不同，加热后，黄金芽鲜叶各色素含量变化程度远小于鸠坑品种（图6a 和6b）。前者的叶黄素（P＜0.001）、脱镁叶绿素a（P＜0.001）以及β-胡萝卜素（P＜0.01）含量加热后都显著下降，而加热后的鸠坑品种鲜叶除了叶黄素以外，其它5 种色素（包括叶绿素a/b、脱镁叶绿素a/b 以及β-胡萝卜素）含量均显著上升。黄金芽与鸠坑品种鲜叶加热后各色素含量变化之间的差异或许是由二者不同的生理结构造成，使得鸠坑品种鲜叶色素的耐热性更强。鸠坑鲜叶的叶绿素a/b 含量加热后显著升高似乎有违常理，这与Pumilia 等[16]的研究颇有相似之处，该研究发现于138 ℃烘焙5 min 的开心果中叶绿素a/b含量反而比鲜果原料更高。其原因在于高温作用下叶绿素-蛋白复合物结构遭到破坏，使得叶绿素呈游离状态，同时也更易于浸提[17]。然而，游离态的叶绿素稳定性更差，更容易受光热作用发生降解，生成脱植基叶绿素、脱镁叶绿素等，这可能也是图6b 中鸠坑鲜叶加热后脱镁叶绿素含量显著升高的原因。

相较于上述的各色素变化情况，黄金芽与鸠坑鲜叶的绿色素和黄色素相对含量变化趋势（图6c 和6d）较为相似。微波加热处理使得黄金芽（P＜0.05）与鸠坑（P＜0.001）品种鲜叶的绿色素相对含量显著提高而黄色素含量则显著降低，从而绿色素/黄色素比值均得以提高，鸠坑品种的变化尤其显著。相较于黄金芽，色素组分变化更显著的鸠坑鲜叶外观色泽反而变化甚微，由此推断鸠坑品种鲜叶中，除本研究6 种色素以外还含有大量其它呈色物质，这些物质的存在在一定程度上可对高温短时加热引起的变化起到暂时的缓冲作用，而黄金芽由于先天的特殊性，这种“缓冲作用”微乎其微。

此外，正如前文所提及，黄金芽和鸠坑品种鲜叶中均没有检测到脱镁叶绿素b 的存在，鸠坑品种鲜叶在加热后大量出现脱镁叶绿素b，而黄金芽并没有。这或许是由于黄金芽鲜叶内缺少转变为脱镁叶绿素b 的前体物质或该转化过程的必要物质，对此并无相关文献报道，其内在机制有待进一步探索。

2.4 闷黄对干茶色泽的影响

黄金芽品种鲜叶经未闷黄处理后，外观色泽由黄变绿（图2a 和2c），对应的色差参数L*/a*/b*/C*值均显著减小（图7a），由此，其鲜叶原本特殊的色泽优势难以凸显。若采用闷黄处理，这一问题可得到有效解决。如图7a，闷黄处理后的黄金芽干茶色差的各项指标相较于未闷黄处理组均与鲜叶差异更小，成品茶外观色泽更黄亮均匀（图2d）。于是，推断闷黄处理可以最大化地发挥黄金芽品种乃至是该类白化茶树品种鲜叶的特殊色泽优势。而鸠坑品种鲜叶在处理过程中，色差指标L*/b*/C*/h°均会显著减小，而a*值由负转正（图7b），对应干茶的视觉效果由原本鲜叶的深绿色（图2e）明显变浅（图2g）转而向黄色（图2h）发展，并且色泽变暗，而闷黄处理对此并无显著改善，反而有加剧这一变化程度的趋势。这一点，或许正是由于上文所推断，鸠坑品种鲜叶含量丰富的各色素物质虽然能够有效缓冲短时高温加热引起的变化，但对于漫长的热加工过程却适得其反，而黄金芽品种恰恰是因为各色素含量稀少，反而在加工过程中表现得较为稳定。

图6 加热处理对鲜叶色素含量的影响Fig.6 The effect of thermal treatment on pigments content of tea samples

图7 闷黄处理对干茶色差的影响Fig.7 The effect of piling treatment on chromatism of tea samples

图8 的色素含量数据结果显示，闷黄或未闷黄处理都会使得鲜叶中的各色素含量发生显著变化，且黄金芽与鸠坑变化趋势基本保持一致。其中，叶黄素和β-胡萝卜素等类胡萝卜素含量水平在处理过程中均会显著降低（图8a 和8b），因为茶叶干燥过程中的高温湿热作用易使类胡萝卜素发生氧化降解，而这也正是茶叶香气形成的关键过程[18]。而叶绿素变化情况较为复杂，未闷黄处理可使叶绿素a/b 和脱镁叶绿素a/b 含量水平均显著提高，而闷黄处理反而使得这些色素含量显著降低（图8a 和8b）。结果导致闷黄处理的黄金芽各色素含量以及两大类色素相对含量水平均与鲜叶状态下无显著差异（图8a 和8c）。由此可见，闷黄处理更有利于黄金芽鲜叶色泽优势的凸显。

图8 闷黄处理对干茶色素含量的影响Fig.8 The effect of piling treatment on pigments content of tea samples

3 结论

黄金芽，作为白化茶树品种之一，相较于常规茶树品种外观色泽具有一定特殊性，呈现嫩黄色且亮度、光泽度较佳。然而，黄金芽鲜叶经过加热或是杀青后其色泽发生显著变化，转而呈现鲜绿色；黄金芽鲜叶按正常绿茶工艺加工所得的成品茶与其它嫩度较好的常规名优绿茶并无太大区别，因此其色泽特殊性的优势未能最大化发挥。研究发现，黄金芽鲜叶加热后之所以色泽由嫩黄转变为鲜绿，是因为以叶黄素为代表的黄色素含量显著降低，致使绿色素/黄色素比值显著升高。而黄金芽鲜叶在加工初期受热后色泽变绿的情况，可在后续的闷黄工艺中得到有效改善，使得闷黄处理后的成品茶相较于未闷黄的茶叶，外观色泽与内在色素含量均与鲜叶状态差异更小，由此可见，闷黄处理有利于黄金芽乃至此类白化茶树品种鲜叶的色泽优势在成品茶中更好地呈现。