HPLC测定血复生片中黄芪甲苷的含量

张岑玥，王国香，全姬善*

（1.延边大学，延吉133000；2.吉林京辉药业股份有限公司，通化134000））

血复生片由黄芪、当归、熟地黄、白芍等十六味药材加工而成，方中除山药和茯苓为生粉入药外，其余几味为提取后入药[1]。卫生部标准无含量测定[2]，国家食品药品监督管理总局国家药品标准WS3-B-2688-97-3，采用薄层色谱扫描法[3]测定黄芪甲苷的含量，该方法操作繁琐，重复性差，准确度不好。本次采用HPLC法-蒸发光散射检测血复生片中黄芪甲苷的含量，经方法学考察，方法简单快速可行、准确可靠、重现性好。

1 仪器与试剂

Waters Acquity Arc高效液相色谱仪；Alltech ES2000蒸发光散射检测器；Sartorius CP225D电子天平；Sartorius BSA224S-CW电子天平；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；乙腈 （色谱纯，美国TEDIA公司）；重蒸水；其它试剂为分析纯；黄芪甲苷对照品（批号：110781-201717，纯度96.9%，中国食品药品检定研究院）；血复生片样品（吉林京辉药业股份有限公司20190101,20190102,20190103）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性实验

色谱柱 ：Waters色谱柱 SunFire C18（4.6×250mm 5μm）；流动相：以乙腈-水（32:68）为流动相；用蒸发光散射检测器检测；流速：1.0ml·min-1；漂移管温度：105℃，气体流速：3.0L·min-1；柱温：30℃；对照品进样量为 3μL、10μL， 样品进样量为20μL； 分析时间：15分钟，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

2.2 对照品溶液的制备

取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品30片，除去包衣，精密称定，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含4%浓氨试液的80%甲醇溶液 （取浓氨试液4ml，加80%甲醇至100ml，摇匀）50ml，密塞，称定重量，加热回流 1 小时，放冷，再称定重量，用含4%浓氨试液的80%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心（5000转）5分钟，取上清液，精密量取25ml，蒸干，残渣用80%甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液3μl、10μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性实验

分别按工艺方法制备缺黄芪的阴性供试品，并按供试品制备方法提取，制成阴性供试品溶液。精密吸取对照品溶液，供试品溶液及阴性供试品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，绘制色谱图。从图上可见，在与对照品色谱峰相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，而阴性液在此峰处无干扰。 详见下图 1、2、3。

图1 血复生片阴性样色谱图

图2 血复生片对照品色谱图

图3 血复生片供试品色谱图

2.5.2 线性关系的考察

精密称取黄芪甲苷对照品（110781-201717，纯度为96.9%）13.87mg，置25mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、3、5、10、20、30μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积值。以进样量的对数为横座标（X），色谱峰面积的对数为纵座标（Y），绘制标准曲线，得回归方程y=1.5916 x+5.3686，r=0.9996。测定结果表明，进样量在0.5376～16.1280μg范围内线性关系良好，结果见表5。

表5 线性范围考察实验结果

2.5.3 精密度实验

取批号20190101的供试品，按供试品溶液制备方法实验，精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪中，连续进样6次，测定色谱峰面积，结果见表6，结果表明精密度良好。

表6 精密度实验结果

2.5.4 稳定性实验

取批号20190101的供试品，按供试品溶液制备方法实验，分别于配制后 0，2，4，12，13 小时，依法测定,结果表明,供试品溶液在13小时内稳定，结果见表7。

表7 稳定性实验结果

2.5.5 重复性实验

取批号20190101的样品，按供试品溶液制备方法实验，取约3g，精密称定，共取6份,按含量测定方法操作，注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积，计算含量，结果见表8，表明该方法重复性良好。

表8 重复性实验结果

2.5.6 加样回收率实验

采用加样回收法。精密称取已知准确含量（0.5845mg/g）的同一批样品(批号 201901701)6 份，各1.5g，分别精密加入对照品溶液各2mL（0.3901mg/ml），按照供试品溶液制备的方法操作，测定加标样品中黄芪甲苷的含量，计算回收率，结果见表9。

表9 回收率实验结果

2.5.7 样品含量测定

按正文【含量测定】项下方法操作，制备供试品溶液，测定3批血复生片的含量，结果见表10。

表10 含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 流动相比例的考察

参照《中国药典》2015年版一部黄芪【含量测定】项下以乙腈-水为流动相，考察了乙腈-水（32∶68）[1]，乙腈-水（35∶65）两种流动相的比例，结果供试品在乙腈-水（35∶65）时分析时间短，分离良好，因此选择乙腈-水（35∶65）为测定用流动相。

3.2 色谱柱的考察

实验中考察了不同品牌的色谱柱对样品分离的影响，结果显示不同品牌的色谱柱均能够有效分离。

3.3 供试品提取方法的考察

分别采用超声处理40分钟、60分钟，回流提取40分钟、60分钟，实验结果表明加热回流比超声处理提取率高，回流1小时已经基本提取完全，因此提取方法确定为回流提取1小时。

3.4 供试品提取溶剂的考察

采用4%浓氨试液的50%甲醇溶液、4%浓氨试液的80%甲醇溶液、4%浓氨试液的甲醇各50ml，分别回流提取1小时。结果80%甲醇溶液提取率最高，甲醇在溶解残渣时比较困难，因此选择80%甲醇为提取用溶剂。

3.5 供试品取样量的考察

取供试品四份，分别为 2，3，4，5g 进行实验，结果表明2g样品与3g样品提取较完全，为减少称量和测量误差，确定取样量选择3g。

3.6 供试品提取碱性条件的影响考察

取供试品三份，分别精密加入2%、4%、8%浓氨试液的80%甲醇溶液各50ml，进行实验，结果考察的氨水浓度对结果基本没有影响，考虑浓氨的挥发性为保证测试效果，最终选定4%浓氨试液。