小球藻的沼液驯化、抗生素敏感性分析和选择标记筛选

张红兵，史秀英，李会宣，李 磊，李文涛

(河北经贸大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061)

1950年，Oswald等首先提出了微藻处理废水的想法[1]。与传统废水处理方法相比，微藻处理法具有如下优势[2]：氮、磷去除率高，不需要额外碳源而避免了二次污染，运行成本低，废水处理和微藻培养同时进行等[3]。用于废水处理的微藻主要有栅藻(Scenedesmus)、小球藻(Chlorella)、衣藻(Chlamydomonas)等，其中小球藻的处理效果最好[4-5]。

由于微藻在保健品、药物、美容等方面的广阔商业前景，研究者借鉴细菌、酵母和动植物的研究方法，通过基因工程技术赋予微藻新的表型和特征[6]。抗生素选择标记是微藻基因工程的常用手段，因此，分析微藻对抗生素的敏感性、筛选选择标记抗生素意义重大[7]。朱军保等[8]利用卡那霉素、链霉素、氯霉素、氨苄西林和头孢霉素等5种抗生素对4株沙漠小球藻进行抗生素敏感性分析，确定卡那霉素和链霉素可作为沙漠小球藻基因工程的选择标记抗生素；张冬宝等[9]对一株有毒的塔玛亚历山大藻进行了8种抗生素的敏感性实验，发现氯霉素、红霉素、林可霉素、庆大霉素和金霉素可作为该藻基因工程阳性选择标记抗生素，新霉素和链霉素可以用于藻株无菌化培养而应用于甲藻产毒机制和赤潮爆发机理的研究。杨芳芳等[10]探究了3种绿藻对氯霉素和硫酸新霉素的敏感性，确定氯霉素可作为3种绿藻基因工程的选择标记抗生素。

作者在此首先从河北的部分河流水体中分离微藻(大部分是小球藻)，利用奶牛养殖废水沼液对小球藻进行驯化培养；然后通过18S rDNA序列分析和系统发育树构建对沼液适应能力和去除废水沼液中总氮、总磷和COD能力最强的优势藻株进行种属鉴定；最后比较优势藻株对G418、氨苄青霉素、潮霉素的敏感性，筛选小球藻基因工程选择标记的抗生素。

1 实验

1.1 水样、试剂与仪器

按GB/T 1.1-2009方法采集石家庄民心河、邢台小黄河、衡水盐河、保定府河、邯郸沁河的夏季(6月)水样。

DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒，OMEGA BIO-TEK公司；G418、氨苄青霉素、潮霉素，索莱宝公司。

自动细胞计数仪，Countstar公司；GeneAmp®9700型PCR仪；DYY-6D型电泳槽，北京六一仪器厂；UV752N型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；BS124S型电子天平，天津德安特传感技术有限公司；DM-2500型光学显微镜，生物显微镜(中国)有限公司；2205型台式离心机，德国Tuttlingen公司。

1.2 小球藻的沼液驯化

1.2.1 预培养

将采集的水样以10%的接种量接种于装有BG11液体培养基的三角瓶中，置于光照培养箱中预培养，每天人工摇动数次。培养温度(25±1) ℃，光照强度10 000 Lux。

1.2.2 筛选

将预培养的藻株进行平板划线，挑取单藻落转接到无菌的BG11液体培养基中继续培养，每天人工摇动数次。重复数次直至光学显微镜观察为单一藻细胞为止。

1.2.3 驯化

将筛选到的藻种培养至浓度为7×107个·mL-1，以10%的接种量分别接种于装有稀释10倍、5倍的奶牛养殖废水沼液的三角瓶中，置于光照培养箱中培养[11]，测定680 nm处吸光度[12]。每组实验设3个平行。

1.3 优势藻株的种属鉴定

1.3.1 对奶牛养殖废水沼液中总氮、总磷和COD的去除能力

参照GB 11849-89、GB 11893-89、GB 828-2017，测定奶牛养殖废水沼液中总氮、总磷和COD的浓度，计算优势藻株对废水中总氮、总磷和COD的去除率。

1.3.2 18S rDNA序列分析

将优势藻株培养至对数生长期，离心，使藻体干重为0.1 g；用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以相应的18S rDNA引物进行PCR扩增；经琼脂糖凝胶电泳，核实大小；用胶回收试剂盒回收目的条带，送上海生工测序。

引物序列：18S-F:5′-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3′；18S-R：5′-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3′。PCR反应体系(50 μL)：藻液基因组DNA 4 μL；引物(20 μmol·mL-1)各2 μL；2×Taq Master Mix 25 μL；补水至50 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，62 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。

1.3.3 系统发育树的构建

将测得序列通过NCBI网站中BLAST检索系统进行同源性分析[13]，构建系统发育树。

1.4 选择标记抗生素的筛选

将优势小球藻藻液培养至浓度为7×107个·mL-1，分别加入G418、氨苄青霉素、潮霉素至终浓度为20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1，以未加抗生素作为对照，测定680 nm处吸光度，绘制生长曲线，比较优势小球藻对3种抗生素的敏感性，确定小球藻基因工程选择标记抗生素。

2 结果与讨论

2.1 藻株的形态

从石家庄民心河、邢台小黄河、衡水盐河、保定府河、邯郸沁河等水样中筛选到5株藻株，分别命名为X-1、Y-1、S-1、L-1、B-1，其显微镜照片如图1所示。

a～e:X-1、Y-1、S-1、L-1、B-1

从图1可以看出，藻株X-1、Y-1、S-1的细胞均为球形，其中，X-1与拟小球藻属的形态较为相似，呈球状单细胞，直径为10～12 μm；藻株L-1为不规则球形；藻株B-1也为球形，但为多个细胞聚集体。

2.2 藻株的驯化

由于沼液浑浊度较高，成分复杂，大部分藻株难以适应；虽然经过一定比例稀释，但其恶劣的生存环境仍使藻株的生长受到极强的抑制[14]。5株藻株在稀释10倍、5倍的奶牛养殖废水沼液中的生长曲线如图2所示。

图2 5株藻株在稀释10倍(a)、5倍(b)的奶牛养殖废水沼液中的生长曲线Fig.2 Growth curves of five algae strains in 10 times(a) and 5 times(b) diluted dairy farming wastewater biogas slurry

从图2可知，5株藻株在稀释10倍的沼液中的适应能力较强，即稀释5倍的沼液对5株藻株生长的抑制作用较强；藻株L-1在稀释10倍沼液中的适应能力最差；藻株X-1的适应能力最强，且在稀释5倍的沼液中仍能正常生长。原因可能是，一方面藻株X-1本身对沼液的耐受能力较强；另一方面由于生存环境的变化使X-1发生了突变，从而增强了对沼液的耐受能力。

2.3 藻株X-1对奶牛养殖废水沼液中总氮、总磷、COD的去除效果(图3)

图3 藻株X-1对稀释5倍的奶牛养殖废水沼液中总氮(a)、总磷(b)、COD(c)的去除效果Fig.3 Removal efficiency of TN(a),TP(b),and COD(c) in 5 times diluted dairy farming wastewater biogas slurry by algae strain X-1

废水中的N、P等可以作为营养物质被藻株X-1吸收，图3中总氮、总磷、COD浓度的变化充分说明了这一点。0～4 d，沼液环境较恶劣，藻株X-1处于适应期；4～20 d，沼液中的总氮、总磷、COD浓度均出现下降趋势，证明藻株X-1已适应沼液环境，开始正常生长；20 d后，沼液中的总氮、总磷、COD浓度趋于稳定，表明藻株X-1的生长进入停滞状态。计算得到藻株X-1对沼液中总氮、总磷、COD的去除率分别为63.98%、58.26%、44.45%。

2.4 藻株X-1的种属鉴定

藻株X-1经18S rDNA序列分析后，构建系统发育树，如图4所示。

图4 基于18S rDNA部分序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on partial sequence of 18S rDNA

由图4可知，藻株X-1与小球藻属、绿藻属和拟小球藻属等3个属的23条近源藻序列的相似度为98%～99%，最高的相似度出现在X-1与Chlorellasp.之间。

2.5 藻株X-1对抗生素的敏感性(图5)

图5 藻株X-1对抗生素的敏感性Fig.5 Antibiotic sensitivity of algae strain X-1

从图5 a可知：20 μg·mL-1的G418对藻株X-1的抑制作用最小； 80 μg·mL-1和160 μg·mL-1的G418对藻株X-1的抑制作用基本相同，OD680值在前3 d略有上升，第3 d～第5 d趋于平稳，第5 d～第7 d下降，且G418浓度为160 μg·mL-1时下降较快，第7 d时几乎降至0。不同浓度G418对藻株X-1生长的抑制作用大小依次为：160 μg·mL-1>80 μg·mL-1>40 μg·mL-1>20 μg·mL-1。

从图5b可知：前5 d，不同浓度的氨苄青霉素对藻株X-1的生长均具有抑制作用且抑制作用相差不大。5 d后，20 μg·mL-1的氨苄青霉素对藻株X-1的抑制作用减小，OD680值明显上升，至培养结束时，OD680值接近于对照组的；80 μg·mL-1的氨苄青霉素对藻株X-1的抑制作用最好，OD680值最小。不同浓度氨苄青霉素对藻株X-1生长的抑制作用大小依次为：80 μg·mL-1>160 μg·mL-1>40 μg·mL-1>20 μg·mL-1。

从图5c可知：前3 d，20 μg·mL-1和80 μg·mL-1的潮霉素对藻株X-1的抑制作用相近，之后，20 μg·mL-1潮霉素组的OD680值呈对数增大，至培养结束时OD680值均高于其它浓度组，说明20 μg·mL-1潮霉素对藻株X-1的抑制作用最小。前3 d，40 μg·mL-1和160 μg·mL-1的潮霉素对藻株X-1的抑制作用相近；5 d后，40 μg·mL-1潮霉素组的OD680值迅速升高，至第7 d时基本与20 μg·mL-1潮霉素组持平。160 μg·mL-1潮霉素组的OD680值在第1 d～第3 d略有上升，第3 d～第5 d趋于稳定，第5 d后呈下降趋势。不同浓度潮霉素对藻株X-1生长的抑制作用大小依次为：160 μg·mL-1>80 μg·mL-1>40 μg·mL-1>20 μg·mL-1。

综上，G418、氨苄青霉素、潮霉素对藻株X-1的最佳抑制浓度分别为160 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1。为筛选最合适的基因工程选择标记抗生素，比较了藻株X-1对160 μg·mL-1G418、80 μg·mL-1氨苄青霉素、160 μg·mL-1潮霉素的敏感性，结果如图6所示。

图6 藻株X-1对160 μg·mL-1G418、80 μg·mL-1氨苄青霉素、160 μg·mL-1潮霉素的敏感性Fig.6 Sensitivity of algae strain X-1 to 160 μg·mL-1G418，80 μg·mL-1Ampiciuin，and 160 μg·mL-1Hygromycin

从图6可知，前3 d，抗生素G418、氨苄青霉素、潮霉素对藻株X-1生长的抑制作用相近；3 d后，潮霉素组与G418组的OD680值低于氨苄青霉素组的，第7 d时，G418组的OD680值接近0。因此，160 μg·mL-1G418对藻株X-1生长的抑制作用最强，160 μg·mL-1潮霉素次之，80 μg·mL-1氨苄青霉素最弱。这从图7也可以证实，160 μg·mL-1G418组的颜色最接近对照(藻液的颜色越接近对照，抑制作用越强)。因此，选择抗生素G418 作为藻株X-1基因工程中的最佳选择标记抗生素，最佳浓度为160 μg·mL-1。

从左到右依次为：对照、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1

2.6 讨论

本实验从河流水体中分离得到5株小球藻，并用奶牛养殖废水沼液进行了驯化，主要是为了将藻株应用于奶牛养殖废水沼液处理中。因为在养殖场中，粪尿及其沼气化处理过程产生的废水中的无机氮、磷浓度特别高，长期施用于农业灌溉会使土力变差，农作物死亡，而养殖场普遍缺乏处理沼液的有效措施。因此，对分离到的小球藻进行沼液驯化非常重要。本实验将沼液适应能力作为优势藻株的选择标准，藻株X-1对沼液的适应性最好，去除沼液中总氮、总磷和COD的能力最强。

藻株X-1与小球藻属(Chlorellasp.)的形态较为相似，均为球形[15]。为了便于对藻株X-1进行深入研究，本实验通过18S rDNA序列分析对藻株X-1进行分子学鉴定并构建系统发育树，进一步确定了其分类学上的准确位置，结果显示，藻株X-1与小球藻属(Chlorellasp.)的亲缘关系最近。

最近，关于抗生素在微藻中的应用成为了微藻基因工程领域的一大热点。抗生素常作为基因工程的选择标记，而选择合适的选择标记抗生素是建立遗传转化系统的关键环节，以便于把转化体同非转化体分开[16]。因此，本实验选择G418、氨苄青霉素、潮霉素作为筛选抗生素，研究藻株X-1对它们的敏感性。结果显示，浓度为160 μg·mL-1的G418对藻株X-1的抑制作用最强。这与淦志兵等[17]发现的原壳小球藻对G418的敏感性最强结果一致，有所区别的是抗生素G418的浓度不同。由此可见，不同的微藻对不同浓度抗生素的敏感性有所差异。藻株X-1对氨苄青霉素、潮霉素的敏感性较差，虽不能作为X-1的基因工程选择标记，但可用于藻株X-1的无菌化培养，获得无菌藻系。

3 结论

从河北的部分河流水体中分离到5株小球藻，利用奶牛养殖废水沼液对小球藻进行驯化，发现藻株X-1在奶牛养殖废水沼液中的适应能力和去除总氮、总磷和COD的能力最强；通过18S rDNA序列分析和系统发育树构建确定藻株X-1与Chlorellasp.的相似度最高；小球藻X-1对160 μg·mL-1的G418的敏感性最强，因此，可以选择G418作为小球藻X-1基因工程中的选择标记抗生素，最佳浓度为160 μg·mL-1。该研究为小球藻X-1利用G418作为筛选标记构建表达载体、转化小球藻、培养无菌藻系提供了实验依据。