稻谷储藏过程霉菌挥发性物质和品质分析

夏雨杰,汪 静,陈尚兵,邢常瑞,袁 建

(1.南京财经大学食品科学与工程学院,江苏南京 210023;2.南京中储粮粮油质检中心,江苏南6京 211151)

我国是世界上稻谷消费和生产大国,稻谷食用消费约占稻谷消费的80%,全国超过一半的人以大米为主食[1]。水稻收获后除去直接使用,绝大多数以稻谷形式储藏,然而稻谷是有机的生命体,在储藏期间因为水分、湿度等因素的影响,加上稻谷中存在大量微生物,导致曲霉菌与青霉菌的滋生,稻谷发热产生霉变,直接降低储藏稻谷的品质,稻谷储藏的品质与安全防控问题一直是稻谷储藏研究热点[2-4]。

霉菌污染稻谷后,一方面引起稻谷变质,导致这类稻谷的发芽能力极低,降低稻米市场流通性;另一方面易引发人体肝脏的病变,产生神经毒性及免疫毒性,同时致癌、致畸、诱发突变,严重危害人体健康[5-7]。目前对霉菌侵染稻谷研究主要集中于研究霉菌活动特性、生长趋势及霉菌毒素方面。黄淑霞等[8]研究霉菌活动特性发现:霉菌活性与粮食的吸湿性及粮粒外皮有关,霉染粮食的黏度、脂肪酸值、发芽率存在差异。唐小俊等[9]将稻谷高温贮藏,控制95%湿度条件下霉菌数量增加速度最快,总数量随着湿度的上升而增加;将稻谷在高湿贮藏,控制40 ℃条件下增加速度最快,总数量随着温度的升高而增加,霉菌的生长趋势速度随温度湿度的增加而加快,温度湿度越大,稻谷更易霉变。污染霉菌的谷物会产生有毒的次级代谢产物,霉菌毒素溶解性差、分解缓慢、稳定性高,霉菌毒素几乎攻击人体所有器官,破坏机体DNA与RNA结合并抑制蛋白质合成,目前用氨化降解霉菌毒素(水分含量>18%,1%氨水,40～50 ℃时氨化48 h,经6～7 d晾晒之后检测)虽然总体破坏率达到98%,但谷物丧失食用性,使用吸附剂吸附霉菌毒素,但吸附剂化学键之间存在不具选择性及易受机体环境影响[10-11]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

淮稻5号 江苏淮安泾口镇桥头8组;平板计数琼脂培养基PCA、孟加拉红培养基、高盐察氏琼脂培养基、直链淀粉标准溶液、乙醇、盐酸、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司;氯化钠、次氯酸钠 北京精细化学品有限责任公司;α-淀粉酶活性检测试剂盒、脂肪酶(LPS)活性检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;过氧化物酶测试盒 南京建成生物工程研究所;黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、产黄青霉 北京微生物菌种中心。

XOGZ-8 KW型连续隧道式微波干燥灭菌线 南京先欧仪器制造有限公司;BLH-3250型试验用砻谷机、JNMJ6型检验碾米机 浙江台州市粮仪厂;101-34S型电热鼓风干燥箱 上海苏进仪器设备厂;SX-700型高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;GNP-9160型隔水式恒温培养箱、GHP-250型智能光照培养箱 上海三发科学仪器有限公司;VOSHIN-600R型无菌均质器 无锡沃信仪器有限公司;PQX-300D多段可编程人工气候箱 宁波东南仪器有限公司;TM-3000扫描电子显微镜 日本株式会社日立制作所;GC(7890A)-MS(5975C)气质联用分析仪 美国安捷伦公司;50 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取头 美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 孢子悬浮液制备 将黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、产黄青霉4种霉菌接种于察氏培养皿上,(28±1) ℃培养5 d,无菌水洗脱孢子于锥形瓶中,用无菌纱布过滤除去菌丝体,4000 r/min离心15 min,血球计数板计数,0.85%生理盐水将浓度调至105～106CFU/mL摇匀。

取样:稻谷60 g分为5等份,4份样品接种4种不同的菌悬液,1份作为空白对照组,4组平行。样品均储藏(28 ℃、80% RH),每隔7 d测定样品菌落总数。

1.2.2 霉菌孢子悬浮液孢子数测定 参照LS/T 6132-2018 《储粮真菌的检测》 孢子计数法进行测定。

1.2.3 霉菌菌落总数测定 参照GB 4789.15-2016《食品微生物学检验》 霉菌和酵母计数进行测定。

1.2.4 稻米品质测定

四是地区之间低保标准差距较大。由于低保属于社会救助范畴，基本按照行政隶属关系承担本级社会救助支出责任，只有大的自然灾害才由中央财政安排专项灾害救助资金。因此，经济发达的省份财政支持能力较强，城乡低保资金投入就多，人均低保标准就高；而经济较落后的西部地区，地方财政依靠中央财政转移支付维持运转，投入到城乡低保的资金就少，低保标准明显偏低。从农村低保标准看，2017年12月排在前3位的地区分别是上海市人均每月970元，北京市900元，天津市860元；排在后3位的地区分别是青海省人均每月277.9元，广西壮族自治区278.2元，云南省278.5元。最高的上海市是最低的青海省的3.49倍。

1.2.4.1 稻谷标准测定 稻谷出糙率测定参考GB/T 5495-2008方法;稻谷整精米率测定参考GB/T 21719-2008方法;稻谷不完善粒测定参考GB/T 5494-2008方法;大米垩白粒率测定参考GB/T 17891-2017方法;稻谷水分测定参考GB 5009.3-2016方法;稻谷直连淀粉含量测定参考GB 15683-2008方法;稻谷糊化特性测定参考GB/T 24852-2010方法。

1.2.4.2 稻谷α-淀粉酶活力测定 采用试剂盒测定其酶活,淀粉经水解酶催化水解产生还原糖,还原3,5-二硝基水杨酸产生棕红色物质,测定在540 nm处吸光度增加速率,计算得出淀粉酶活性大小。酶活力按照每g稻谷每隔一分钟催化后产生1 mg还原糖作为1个酶活力单位。

1.2.4.3 过氧化物酶活力测定 采用试剂盒测定其酶活,过氧化物酶催化过氧化氢反应,测定波长在420 nm处吸光度的变化规律,判断其酶活性大小。酶活性大小依据每g稻谷每一分钟催化底物量为1 μg的酶量作为一个酶活力单位。

1.2.4.4 脂肪酶活力测定 采用试剂盒测定其酶活,脂肪酶催化油酯水解成脂肪酸,采用铜皂法测定脂肪酸生成效率,在波长420 nm处测定吸光度变化情况。其活力大小依据每g稻谷每分钟水解油脂生成1 μmol脂肪酸作为一个酶活单位。

1.2.5 大米微观结构的测定-扫描电子显微镜测试 样品颗粒粘在扫描电镜样品盘,放入离子溅射仪的喷金室(溅射电流为1.5 A,加速电压为15 kV,溅射时间90 s)。扫描电镜下观察稻谷及糙米表面菌落状态。

1.2.6 GC-MS采集 从样品接种霉菌开始,选择时间节点0、7、14、21、28 d,从中取出20.00 g在GC-MS仪器上检测分析,置于100 mL固相微萃取样品瓶,气相色谱进样口(250 ℃),解吸5 min。起始温度50 ℃,保持5 min,然后以8 ℃/min的升温速度升温到125 ℃,再以4 ℃/min的升温速度升温到165 ℃,最后以10 ℃/min 的速度升温到230 ℃,保留2 min。

GC-MS相关仪器参数条件:色谱柱型号:HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm,0.24 μm);载气:氦气;载气流速:24.00 mL/min;采用不分流进样模式;AUX-2温度:280 ℃;离子源:EI;离子源温度:230 ℃;电子能量:70 eV;采集模式:全扫描[13]。

1.3 数据处理

图表由Origin Pro 2016绘制,数据由SPSS 22.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 染菌稻谷菌落总数

侵染优势菌的稻谷与未接种的稻谷样品表面霉菌生长情况如图1所示。由图1可知,受霉菌侵染稻谷的霉菌生长较快,且霉菌生长较快的稻谷在后期发生较严重霉变现象,其中黑曲霉、黄曲霉、产黄青霉生长速度较快。田国军等[14]在研究不同储藏条件下稻谷霉菌总数变化规律时发现,稻谷处于合适的温湿度条件下,粮食不易发生霉变。同时相关研究发现，粮食储藏过程中，随着时间的延长，阿姆斯特丹曲霉会取代黄曲霉成为优势霉菌,但黑曲霉一般含量不变[15]。在稻谷储藏过程当中微生物会引起一系列的代谢变化,产生特殊性气味,优势菌也会随着发生变化。

图1 稻谷样品菌落总数变化

2.2 染菌稻谷感官品质分析

染菌稻谷的质量检测指标如表1所示。不同霉菌侵染28 d后,稻谷品质与第0 d和未接种样品相比较,在出糙率、整精米率方面均有下降,染菌稻谷整体的不完善粒率在上升。在稻谷储藏期间,稻谷表面优势菌的生长导致稻谷质量下降。参照GB 1350-2009对三级精米的要求:整精米率≥55%,不完善粒率≤5%。染菌稻谷因为在储藏期间,霉菌存在活性,会破快稻谷表观品质因此物检不完善粒时,发现霉变粒、病斑粒、虫蚀粒的数量上升,出糙率、整精米率、不完善粒率检测结果均低于国家优质精米要求;染菌的稻谷整精米率明显下降,是由于在储藏过程中染霉稻谷自身的呼吸作用加快使干物质消耗量增多,从而引起稻谷组织疏松,整精米率下降[16-17]。

表1 稻谷感官品质检测结果

2.3 染菌稻谷理化品质分析

稻谷酶活力代表着稻谷新陈代谢的能力,酶活力数值高则表明谷物的活性强、新鲜度高、稻谷的品质较好[18]。稻谷是以淀粉为主的淀粉类粮食,存在α-淀粉酶,α-淀粉酶会酶解淀粉,在实际的储藏过程中,α-淀粉酶活性是随着储藏时间的延长而变化的,对稻谷的食用品质产生一定的影响[19]。未接种与初始值稻谷比较发现,α-淀粉酶的活力降低了0.07 mg/(min·g),并存在显著差异(P<0.05)。比较染菌稻谷和未接种稻谷α-淀粉酶活力值,发现染菌稻谷的酶活力远低于未接种稻谷的酶活力,稻谷染霉后α-淀粉酶活性逐渐降低,稻谷淀粉颗粒形态组成发生变化,样品的直链淀粉含量升高,表明稻谷品质下降,容易导致米饭蒸煮过程中水分难以渗透,制得的米饭口感较硬。因为在一定范围内,直链淀粉含量越低,稻米品质越好[20]。

过氧化物酶存在于粮食籽粒中,与粮食口感密切相关。大米随着储藏时间延长,过氧化物酶活性会减弱[21]。由表2可知,随着储藏时间的延长,染菌组、未接种稻谷的过氧化物酶值与储藏第0 d的稻谷相比均下降,并与初始值存在显著性差异(P<0.05)。

表2 稻谷品质指标测试结果

脂肪酸含量是评价稻谷是否宜存的重要指标,一般来说脂肪酸值越高,粮食品质越差,越不易于储藏[22]。侵染优势霉菌组稻谷的脂肪酸值与未接种稻谷脂肪酸值相比显著升高(P<0.05),同时依据国家标准GB/T 20569-2006受霉菌侵染严重的大部分稻谷已不适宜继续储存,甚至一些已经不能食用。根据上述结果可以得出在稻谷储藏过程中,过氧化物酶与脂肪酸值呈现负相关,稻谷受到霉菌侵染后α-淀粉酶活力也开始下降,因此整体表现为稻谷气味酸败和口味变差。

2.4 染菌稻谷糊化特性分析

RVA谱特征值反映淀粉粘滞特性与米饭的食味品质存在关联[23]。随着储藏时间的延长,染菌稻谷淀粉粒表面的亲水作用减弱,水分渗透细胞的能力和速度下降,大米溶胀程度受到抑制,峰值黏度和崩解值下降,同时加上微生物的代谢作用,淀粉结构易被破坏,表明大米出现明显陈化[24]。

消减值与米饭冷却后的质地相关联,一般消减值为负值,米饭往往过黏;消减值为正值且过大时,米饭硬而糙,消减值小则软而不黏结[25]。从表3可以看出,受霉菌侵染的稻谷的消减值处于181.5～248.7 cp的范围,未接种霉菌稻谷的消减值约为-436.0 cp。

表3 稻谷淀粉糊化过程中的特征值

回生值的大小与直链淀粉的聚合度及支链淀粉的微观结构有关,直链淀粉聚合度高,易于被老化的是外链长的支链淀粉[26]。未接种霉菌与染菌霉变稻谷之间回生值不存在显著性的差异。同时糊化温度也是揭示淀粉品质的指标之一,当淀粉糊化温度比临界温度高时晶体发生崩解,黏度值突然升高,溶胀现象开始出现,并且越来越接近峰值黏度。染菌组稻谷的糊化温度处于72.8～74.6 ℃的范围,未接种霉菌稻谷的糊化温度约为70.1 ℃,染菌组稻谷样品的糊化温度要略高于未接种霉菌的稻谷,同时也存在显著性差异(P<0.05)。

2.5 扫描电子显微镜分析

本研究采用扫描电子显微镜观察染菌稻谷储藏28 d霉变后去壳后稻谷表面菌的生长状态,不同放大倍数的扫描电子显微镜结果如图2和图3所示。初始组和未接种菌的糙米表面较为光滑,表面无明显聚集,并且稻米颗粒表面较光滑。染菌稻谷去壳后观测到有菌丝体依旧附着在大米表面,说明稻谷的米糠层已被破坏,尽管稻谷储藏期间不同霉菌对稻谷侵染能力不同,但四种霉菌均开始侵染了籽粒内部,结合上述感官、质量品质及糊化品质结果可以推断出，稻谷内部亚糊粉层以及胚部淀粉颗粒均发生一定程度的变化,食用品质开始下降,因此对储粮霉菌安全不容忽视[27-28]。

图2 扫描电子显微镜图谱(200×)

图3 扫描电子显微镜图谱(1000×)

2.6 GC-MS结果分析

根据表4可以看出,在侵染稻谷储藏前期,四种染霉稻谷所测数据并没有太大差异,但随着时间的延长,其气味组成存在差异,分析在储藏期间,微生物的生物活性在不断发生变化,引起挥发性气味产生差别。酮基、醛基羟基等含氧基团和含氮基团是稻谷的挥发性气味的来源,此类物质在稻谷储藏期间的产生差异较大[29-30]。受白曲霉侵染稻谷在储藏期间,苯环类物质相对含量范围在6.74%～15.94%,主要表现是随着时间的变化含量在增加,在后期苯酚类、含氧基团苯环类出现,醛类物质整体上呈现下降趋势,且含量较低,不过与稻谷气味密切相关;受到产黄青霉侵染稻谷,酮类、酯酸类物质含量范围分别在1.86%～8.11%和6.83%～13.56%,都是在第21 d含量较大,说明在储藏后期稻谷已经发生霉变,产生味道方面的差异;受黑曲霉侵染稻谷,醇醚类物质含量在5.39%～11.94%,在储藏后期含量增加较多,醛类物质含量在2.13%～5.12%之间,前期变化较为缓慢,第21 d后发生较大的变化;受黄曲霉侵染稻谷,苯环类物质含量在8.9～16.52%,酯酸类物质含量在8.79%～12.61%,这两类物质相对含量在7 d后有增长的趋势,醛类物质含量变化较为明显,主要原因是黄曲霉侵染稻谷加快脂类酶促氧化产生过氧化物及羰基化合物,脂质水解产生劣变气味物质即醛类物质[31]。随着天数的变化受到霉菌感染程度会不同,所产生的挥发性气味有一定的区别。烃类物质在染霉储藏阶段一直占据主要位置,苯环类物质和醇醚类含量在不断上升,醛、酮类物质含量占据比例较少。霉菌侵染的稻谷表面的生长状态及菌落数差异性,进一步证实了稻谷在储藏阶段产生的挥发性物质成分含量的变化。

表4 稻谷的主要挥发性物质分类及相对含量变化

3 结论

本研究选择将黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、产黄青霉四种常见优势霉菌接种经微波灭菌后的稻谷上,并对其储藏品质进行研究。研究发现霉菌侵染稻谷中受到白曲霉、黄曲霉、黑曲霉的霉菌生长速度较快。染菌稻谷出糙率和整精米率明显降低,不完善粒率明显提高,染菌稻谷的出糙率<77%,整精米率<55%,稻谷品质低于国家三级精米的要求,已然不符合正常的稻谷储藏标准。

染菌稻谷的峰值黏度在3241.5～3698.6 cp之间,低于未接种霉菌的稻谷4781.2 cp,反映染霉稻谷α-淀粉酶活下降,同时糊化温度上升。因此可以推测染霉稻谷淀粉结构因霉菌生物活性发生了变化,淀粉颗粒蓬松易破裂,同时大米直链淀粉含量增加且淀粉的结晶度也会升高,因此染霉稻谷蒸煮出来的米饭,气味酸败,硬度较大,品质整体低于未接种霉菌的稻谷。用扫描电子显微镜可以观察到染霉稻谷去壳后表面依旧存在菌丝聚集,稻谷虽有谷壳保护,但霉菌菌丝已通过谷壳缝隙开始侵染稻谷内部并稻谷微观结构。GC-MS对储藏期间染菌稻谷的挥发性气味成分分析显示不同霉菌侵染的稻谷储藏期间挥发性成分的变化有差异,侵染稻谷储藏前期挥发性成分差异不大,但随储藏时间延长烃类、苯环、醇类、醛类、酮类、酯酸组成发生改变,根据染菌稻谷菌落总数变化,可以推测因为微生物生物活性发生变化,引发挥发性气味改变。