发酵时间和方式对面团中酵母代谢产物的影响

岳清华，刘翀，李利民，郑学玲

(河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州， 450001)

发酵是馒头、面包等发酵面制品加工过程中的重要环节[1]。活性干酵母是最常用的发酵剂之一。面团发酵主要取决于CO2的产生，并将其包裹在面团基质中。然而，酵母的作用不仅限于产气,酵母可产生影响终产品香味和风味的代谢物[2-3]。有研究表明，酵母发酵对面团的流变性质也有影响，如面团的延展性降低[4-5]。这些性能对发酵面制品是非常关键的，因为它们决定了面团的行为，从而影响加工性能和终产品的质量。例如，有学者研究了添加有机酸如乙酸和乳酸对面团行为的影响，面团酸化引起蛋白质净电荷增加，导致蛋白质溶解度增加并促进蛋白质折叠。这导致面团稳定性降低[6]。

发酵强度取决于酵母的形式和面粉中可发酵糖的含量。小麦粉中存在少量的游离糖(0.3%～0.5%，主要是葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖)，在面团发酵过程中作为酵母的碳源[7]。其中蔗糖含量是最丰富的，占总可溶性糖的50%以上[7-8]。由淀粉酶对损伤淀粉的作用形成的麦芽糖是源自面粉本身的主要可发酵糖[9]。HENRY等[10]认为影响产品体积的面粉中最重要的碳水化合物是葡萄糖、果糖和蔗糖。这些被不同的酵母发酵的碳水化合物的顺序不是随机的，而是基于特定的顺序，葡萄糖是优先被分解的糖。葡萄糖似乎减慢了果糖的消耗，因为两种糖都是由相同的载体运输的，这些载体对葡萄糖的亲和力比果糖更高[11]。蔗糖很容易被酵母代谢，首先被细胞外酵母转化酶水解，然后将所得的葡萄糖和果糖等单糖吸收并代谢。乙醇和CO2是这种酵母代谢的主要终产物[12]。但是，其他几种代谢产物如甘油和有机酸也都大量产生。这些所谓的次级代谢产物的产生被认为对维持面团内部氧化还原平衡和抵抗高渗透压是必不可少的。存在于面粉和酵母制剂中的污染微生物，主要是乳酸菌也可能在面团发酵中起作用，因为它们可能产生有机酸如乳酸[13]。

虽然已经使用酶法和各种HPLC方法[14]在面团系统中定量了糖，乙醇和某些有机酸等[15-16]。然而一次发酵面团制作及不同发酵方式面团中有关糖利用率和不同代谢物产生的数据相当零碎且不完整。此外，大多数研究仅测定一种或几种代谢物，这使得很难对代谢产物获得全面了解。在此，基于特定色谱柱和高效液相色谱的方法了解酵母营养物质和代谢产物浓度的变化，可为研究这些代谢物对面团的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

高筋小麦郑麦366(ZM366)、中筋小麦矮抗58(AK58)、低筋小麦郑麦103(ZM103)，其小麦粉粗蛋白质量分数和面筋指数分别为(13.33±0.04)%和(94.28±0.20)%、(12.24±0.05)%和(69.53±1.83)%、(11.59±0.08)%和(48.56±2.70)%，河南省农科院；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。

蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳酸、甘油、乙酸和乙醇标品，阿拉丁试剂上海有限公司。

1.1.2 仪器与设备

SZM-10搅拌机，广州旭众食品机械有限公司；SP-18S醒发箱，江苏三麦食品机械有限公司；JMTD-168/140实验压片机，北京东孚久恒仪器技术有限公司；Avanti J-E离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；料理机，九阳股份有限公司；Aglient 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 面团制备

(1)直接发酵面团：面粉，添加质量分数1%的酵母，按照面粉的吸水率加水适量，和面5 min，压面8道。

(2)中种发酵面团：将质量分数为50%面粉、0.5%酵母以及和面所需的全部水加入和面钵中和面5 min。此状态的面糊于35 ℃、湿度85%的醒发箱中发酵3 h后加入剩余面粉，和面5 min。压面8道。

(3)老面发酵面团：面粉，添加质量分数1%的酵母，加水50%(质量分数)，于35 ℃、湿度85醒发箱中发酵12 h，制成老面团。随后加入面粉，老面团质量分数50%，加水适量，和面5 min，压面8道。将面团分割成若干适量的小面团，最后手工揉制成型。

1.2.2 pH和总酸度(total acidity，TTA)的测定

参照王大一[17]中pH和TTA测定方法。

1.2.3 面团中可溶性糖、有机酸及醇类物质测定分析

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱，REZEX ROA-Organic Acid H+,300 mm×7.8 mm,8 μm；温度60 ℃；流动相，2.50 mmol/L H2SO4，流速为0.60 mL/min。

1.2.3.2 标准品的制备

准确称取乳酸 9 mg，乙酸 3.5 mg，乙醇 110 mg，甘油4 mg，葡萄糖150 mg，果糖50 mg，麦芽糖100 mg，蔗糖1 mg，分别用纯净水溶于50 mL容量瓶中，然后稀释至不同浓度，进样20 μL。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别做标准曲线，计算回归方程，同时制备所有样品的混合标样，分别吸取各样品3 mL溶于25 mL容量瓶中， 进样20 μL，作为标准图谱。

1.2.3.3 面团中可溶性糖、有机酸及醇类物质含量测定

取15 g发酵面团于50 mL去离子水(冰水)中，高速均质30 s。取10 mL浆液于4 ℃，20 000×g离心5 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤。每个样品做2次平行。

2 结果与分析

2.1 发酵时间及方式对面团pH和TTA的影响

面团pH和TTA是面团发酵过程中的重要指标。pH反映面团中H+的浓度，总酸度表征面团的酸味程度。图1显示发酵过程中面团pH和TTA的变化。随着发酵时间的延长，pH下降，总酸度升高。由图1-a可知，在发酵12 h的过程中，3种小麦粉的pH都呈下降趋势，在0～3 h显著下降。这是因为乳酸菌在发酵开始阶段快速产酸从而使pH降低以适应酵母菌的生长，两者都达到最佳生长状态[18]。而ZM103在发酵9～12 h其pH下降较为显著，这可能是面粉筋力不同从而使得酵母代谢速率不同。在整个发酵过程中，3种小麦粉面团的TTA随时间推移都呈上升趋势(图1-c)，但在发酵22 min～3 h变化不显著。3种不同发酵方式的面团pH都随发酵时间的增加而降低(图1-b)，在0～45 min下降最为显著。主要是面团在发酵刚开始时，内部有大量的空气供酵母菌进行有氧呼吸。与中种和老面发酵面团相比，一次发酵面团pH值变化较大，这可能是一次发酵中没有已经发酵过一段时间的面头，内部所有的酵母菌都进行旺盛的有氧呼吸。在中种发酵面团中，由于将50%(质量分数)的面粉先发酵3 h，而面糊中含有一定量的酸使得此发酵方式下面团的初始pH最低。中种发酵面团pH变化最为平缓，3种发酵方式90 min时pH值接近。它们的TTA都呈逐渐上升趋势(图1-d)，但是同种发酵方式在90 min的发酵过程中TTA变化并不显著。

a-发酵时间对面团pH的影响;b-发酵方式对面团pH的影响;c-发酵时间对面团TTA的影响;d-发酵方式对面团TTA的影响图1 发酵过程中面团pH和TTA变化情况Fig.1 The pH and acidity of dough during fermentation

2.2 发酵时间及方式对面团中有机酸含量的影响

面团发酵过程中乙酸和乳酸含量的变化如图2所示。随着发酵时间的延长，不同筋力小麦粉在发酵9 h内其乙酸含量都呈上升趋势(图2-a)，然后在9 h后出现下降。发酵9 h时，面团中乙酸浓度最大，ZM366、AK58及ZM103中的乙酸含量分别为0.832、0.362和0.399 mg/g面团。不同筋力小麦粉中其乙酸含量增长速度不尽相同，其中高筋小麦粉ZM366在6～9 h急剧增加，并在发酵9 h时的含量高于中筋和低筋小麦粉。不同发酵方式下面团中乙酸的含量变化如图2-b所示。乙酸含量都呈增加趋势，但增长速度不同，其中直接发酵面团乙酸含量变化最大，而老面发酵面团变化最小。不同发酵方式面团中最终乙酸含量接近。

由图2-c可知，发酵面团中乳酸含量在发酵67 min内随着发酵时间的增加而增加，而后呈波动变化。不同筋力小麦粉发酵12 h后其乳酸含量差异显著，ZM366、AK58及ZM103面团中的乳酸含量分别为0.763、0.467和0.376 mg/g面团。在发酵90 min前，中筋小麦粉AK58的乳酸含量增加速度较快。不同发酵方式面团中乳酸的含量变化如图2-d所示，乳酸含量在一次和中种发酵面团中呈现先上升再下降的趋势，老面发酵面团中乳酸含量随着发酵时间呈整体递增趋势，并在90 min时达到最高0.5 mg/g面团。由于发酵时间的增长，面团中的一些环境就会发生变化，其中主要包括水分活度、pH值等，菌种的产酸能力会因面团环境改变而发生变化，而且生成的有机酸还可与酒精等反应生成酯、醛、酮等风味物质[19]。这些因素都会对面团中有机酸含量的变化造成影响。此外，根据有机酸度的含量可大致判断面团的发酵程度，并可为发酵面制品的风味分析提供参考[20]。

a-发酵时间对面团中乙酸含量的影响;b-发酵方式对面团中乙酸的影响；c-发酵时间对面团中乳酸含量的影响;d-发酵方式对面团中乳酸含量的影响图2 发酵过程中面团有机酸含量变化情况Fig.2 The organic acids of dough during fermentation

2.3 发酵时间及方式对面团中可溶性糖含量的影响

发酵时间和方式对面团中可溶性糖含量的影响如图3所示。由图3-a可知，随着发酵时间的增加，葡萄糖含量在短时间(0～90 min)显著下降，而发酵3 h后，面团中葡萄糖的含量变化幅度较小，发酵6 h后，葡萄糖含量又略微上升。3种筋力小麦粉均在发酵6 h时，面团中葡萄糖的含量达到最低，分别为ZM366(0.297 mg/g面团)、AK58(0.290 mg/g面团)和ZM103(0.323 mg/g面团)。其中AK58的葡萄糖含量下降最为显著，说明AK58(中筋)在短时间的发酵过程中葡萄糖的降解速度要大于ZM366(高筋)和ZM103(低筋)。3种发酵方式下，随着发酵时间的增加，面团中的葡萄糖含量均呈降低趋势(图3-b)，但下降速率不同。直接发酵面团中葡萄糖含量变化最为显著，老面发酵法葡萄糖含量变化最不明显。中种发酵面团中葡萄糖含量明显低于另外两种发酵方法，可能是由于中种发酵过程中葡萄糖在制作中种面团的过程中被分解消耗较多。在发酵90 min后，直接、中种和老面发酵的面团中葡萄糖的含量分别为1.365、0.428和3.948 mg/g面团。

3种不同小麦粉在发酵过程中其麦芽糖含量整体上都随发酵时间的增加而降低(图3-c)。在前90 min发酵时间内显著下降。在发酵到6 h时，麦芽糖含量基本达到最低值，ZM366、AK58和ZM103中的麦芽糖含量分别为0.193、0.088和0.028 mg/g面团。同样中筋小麦粉AK58面团中麦芽糖的含量消耗最快。而后发酵9 h后，麦芽糖含量又有略微上升的趋势。ZM103小麦粉在发酵开始阶段，麦芽糖含量有所增加，这可能是面团中葡萄糖的浓度足够高，且小麦粉本身含有大量麦芽糖，其次麦芽糖的生成速率大于其被消耗的速率。总体来看，麦芽糖含量随着发酵时间的延长而降低。3种发酵方式下(图3-d)，直接发酵过程中麦芽糖的含量变化较显著，从4.021 mg/g面团(0 min)到0.161 mg/g面团(90 min)。而中种和老面发酵面团中的麦芽糖含量缓慢下降。而发酵90 min后，直接和中种发酵面团中麦芽糖含量相差较小，而老面发酵面团中麦芽糖含量显著高于前两种发酵方式的面团。随着发酵时间的增长，麦芽糖被逐步消耗分解。

由图3-e可知，3种小麦粉在发酵过程中，ZM366、AK58中果糖含量都呈现逐步下降的趋势，而低筋ZM103在短时间的发酵过程中果糖的含量呈先略微上升而后下降的趋势。短时间发酵，低筋ZM103的果糖含量一直高于高筋ZM366和中筋AK58的果糖含量。发酵过程中果糖的含量一直下降，说明不同筋力小麦粉在发酵时果糖一直处于被分解的状态。而ZM103中发酵初始阶段果糖含量略有上升可能是由于发酵初始阶段面团中的蔗糖被转化成部分的果糖，且速度较快，高于ZM103本身含有的果糖被分解的速度。所以导致果糖含量有所上升，后期发酵过程中蔗糖被分解完，不再转化生成果糖，所以果糖的含量就开始下降。3种小麦粉均在发酵3 h后检测不到果糖，说明果糖此时被消耗完全，其中低筋ZM103的消耗速度最快。整体上，3种发酵方式下，面团中的果糖含量随着发酵时间的增加呈降低趋势(图3-f)。但不同发酵方式下，果糖被消耗的速度不同。直接发酵面团中果糖含量变化最显著，从3.047 g/g面团(0 min)降低至0.190 mg/g面团(90 min)；中种发酵面团果糖分解速率次之，但发酵90 min时果糖含量达到最低值，果糖被完全分解；老面发酵面团中果糖被分解的速度最为缓慢。在整个发酵过程中，中种发酵面团中果糖含量始终低于另外两种发酵面团，可能是由于果糖在制作中种面团的过程中被分解消耗较多。

在用高效液相色谱法检测不同发酵时间及方式可溶性糖含量变化的过程中几乎检测不到蔗糖的含量，可能是由于蔗糖很容易就被酵母代谢[21]，在发酵刚开始就被迅速分解。这是由于酵母中存在非常活跃的转化酶，在揉捏阶段将面粉中的蔗糖转化为葡萄糖和果糖。因此，在所有的发酵面团中，蔗糖快速地消耗，在混合样品制备所需的时间后没有留下蔗糖。糖类物质的消耗与酵母的代谢紧密相关，全面了解发酵过程中可发酵糖类物质的消耗规律，有助于发酵程度的判断。糖类物质可改变面团的生化特性甚至物理特性[22]，测定糖的含量可为研究其对面团性质的影响提供基础。

a-发酵时间对面团中葡萄糖含量的影响;b-发酵方式对面团中葡萄糖含量的影响;c-发酵时间对面团中麦芽糖含量的影响;d-发酵方式对面团中麦芽糖含量的影响;e-发酵时间对面团中果糖含量的影响;f-发酵方式对面团中果糖含量的影响图3 发酵过程中面团可溶性糖含量变化情况Fig.3 The soluble sugars of dough during fermentation

2.4 发酵时间及方式对面团中醇类物质含量的影响

面团发酵过程中乙醇含量的变化如图4所示。乙醇含量在发酵3 h内随着发酵时间的增加而增加(图4-a)。3种面粉均在发酵3 h后其乙醇含量首次达到峰值，ZM366、AK58和ZM103的乙醇含量分别为4.905、6.312和8.383 mg/g面团。随着面团进一步发酵，乙醇含量呈先下降后再上升再下降的趋势。虽然乙醇含量在长时间发酵过程中变化波动，但发酵结束后乙醇含量相对于开始发酵时显著增加。最终3种小麦粉面团的乙醇含量相近，约为5 mg/g面团。在发酵后期乙醇含量波动变化主要是因为乙醇不断和酸类发生反应，且乙醇也不断产生。不同发酵方式下，面团中乙醇含量随着发酵时间的增加而增加(图4-b)。直接发酵面团中的乙醇含量变化最大，老面发酵面团中乙醇含量变化最小。在发酵90 min后，直接、中种和老面发酵的面团中乙醇的含量分别为4.081、6.100和4.403 mg/g面团。

面团发酵过程中另一醇类物质即甘油。面团发酵过程中甘油含量的变化如图4-c和图4-d所示。可以发现不同发酵时间及方式下分别相对应的面团中甘油含量和乙醇含量的变化趋势基本一致。这可能是酵母产生甘油的代谢途径与乙醇相似。发酵过程中产生的酸、醇等及它们的相互作用形成的新物质是构成发酵面制品风味的重要成分，将直接影响终产品的风味[23]，这些相关物质的变化规律可为发酵面制品的风味分析提供参考；糖酵解、产酸、产甘油能力等都可能影响馒头等发酵面制品的品质。酿酒酵母发酵过程中产生的甘油等代谢产物可以有效地改善馒头质构特性并延缓馒头老化，研究这些代谢物质的规律对研究减缓馒头老化提供依据[24]。

a-硫化氢发酵时间对面团中乙醇含量的影响;b-硫化氢发酵方式对面团中乙醇含量的影响;c-硫化氢发酵时间对面中团甘油含量的影响;d-发酵方式对面团中甘油含量的影响图4 发酵过程中面团醇类物质含量变化情况Fig.3 The alcohols of dough during fermentation

3 结论

本研究对3种不同筋力小麦粉高筋ZM366、低筋ZM103及中筋AK58在面团发酵过程中的可溶性糖(蔗糖、麦芽糖、葡萄糖及果糖)、有机酸(乳酸、乙酸)及醇类物质(甘油、乙醇)等主要代谢物的含量进行了研究。蔗糖在发酵面团中被酵母迅速分解，在实验过程中检测不到蔗糖含量。麦芽糖、葡萄糖和果糖在面团发酵过程中总体呈现下降趋势，果糖在发酵3 h后被完全分解。不同筋力小麦粉中糖类物质的消耗速度不同，中筋AK58中葡萄糖的消耗速度最快。面团发酵过程中乳酸、乙酸、甘油和乙醇总体上呈现上升趋势。前3 h发酵过程中，各种代谢物质含量显著变化。不同发酵方式的面团中其代谢物的含量变化存在差异，直接发酵面团中各物质含量变化最大，老面发酵面团中各物质变化幅度较小，中种发酵面团中可溶性糖含量最低，而甘油和乙醇含量较高。发酵过程中酸、可发酵糖及代谢产物的变化可为研究这些物质对面团的影响、发酵程度及发酵终产品品质及风味分析提供参考。