HPLC 法同时测定小儿解表颗粒中6 种成分

何 艳，胡小祥

（1.湘南学院药学院，湖南 郴州 423000；2.郴州市食品药品检验检测中心，湖南 郴州 423000）

小儿解表颗粒为儿科常用方剂，由金银花、连翘、炒牛蒡子、蒲公英、黄芩、防风、紫苏叶、荆芥穗、葛根、人工牛黄10 味药材组成，具有宣肺解表、清热解毒的作用，用于小儿外感风热所致的感冒，症见发热恶风、头痛咳嗽，鼻塞流涕、咽喉痛痒［1］。方中连翘辛凉解表、清热解毒，为君药，主要活性成分为连翘苷、连翘酯苷A［2］；牛蒡子功效解风热之邪、利咽止痛、辛凉解表、清热解毒，其主要有效活性成分为牛蒡苷［3-4］，而黄芩清热解毒，主要活性成分有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素等［5］，两者皆为臣药；葛根性甘、凉，解肌退热，为佐药，其主要活性成分为葛根素［6］。

在2015 年版《中国药典》 小儿解表颗粒项下，仅以黄芩苷为定量测定成分，指标单一，不利于整体质量控制；文献［7-11］中，该制剂都以1～3 种成分含有量为指标进行测定。本实验建立HPLC 法同时测定小儿解表颗粒中葛根素、连翘酯苷A、黄芩苷、汉黄芩苷、牛蒡苷、黄芩素的含有量，涵盖了方中君药、臣药、佐药，以期为该制剂质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置G1311B 四元泵、G1329B 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315D DAD 检测器（美国Agilent 公司）；XSE-205 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水处理系统（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与药物 葛根素（批号110752-201615，质量分数95.4%）、连翘酯苷A（批号111810-201606，质量分数 93.4%）、黄芩苷（批号110715-201619，质量分数93.5%）、牛蒡苷（批号110819-201611，质量分数95.9%）、汉黄芩苷（批号112002-201702，质量分 数95.9%）、黄芩素（批号111595-201607，质量分数98.5%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。小儿解表颗粒（批号171119，四川好医生药业集团有限公司；批号 ZGA1703、ZCA1805、ZBA1804、ZGA1701、ZCA1710，云南白药集团股份有限公司）。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；磷酸、甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Symmetry-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0～15 min，8%～20%A；15～25 min，20%～35%A；25～30 min，35%～40%A；30～35 min，40%A；35～35.1 min，40%～8% A；35.1～ 40 min，8% A）；体积流 量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长0～13 min 时250 nm，13～22 min 时326 nm，22～40 min 时278 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取对照品葛根素10.60 mg、连翘酯苷A 10.89 mg、牛蒡苷10.13 mg、汉黄芩苷9.28 mg、黄芩素5.76 mg，置于50 mL量瓶中，70% 甲醇溶解并稀释至刻度。精密称取3.39 mg 黄芩苷对照品至25 mL 量瓶中，再分别精密吸取上述5 种溶液3、6、8、4、2 mL 置于其中，振摇，70% 甲醇定容，摇匀，即得（含葛根素24.26 μg/mL、连翘酯苷A 48.82 μg/mL、黄芩苷126.8 μg/mL、牛蒡苷62.17 μg/mL、汉黄芩苷29.25 μg/mL、黄芩素9.077 μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液 取颗粒适量，研细，取粉末约0.8 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（300 W、40 kHz）30 min，放冷，70% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按颗粒处方工艺，分别制备缺葛根、连翘、黄芩、炒牛蒡子的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性样品溶液在与对照品溶液相同保留时间处无色谱峰出现；各成分分离效果理想，分离度均大于1.5，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得葛根素、连翘酯苷A、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积 RSD 分别为1.3%、0.23%、0.22%、0.21%、0.27%、0.52%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号ZGA1703），分别于0、2、6、12、18、24 h，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得葛根素、连翘酯苷A、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积RSD 分别为1.2%、1.7%、0.55%、0.25%、0.37%、2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一份样品（批号ZGA1703）6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得葛根素、连翘酯苷A、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷、黄芩素含有量RSD 分别为1.1%、0.55%、0.63、1.4%、0.82%、2.1%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取含有量已知的同一份颗粒（批号ZGA1703），研细，称取粉末约0.4 g，共6 份，精密加入50 mL 含葛根素8.288 μg/mL、连翘酯苷A 3.654 μg/mL、黄芩苷42.64 μg/mL、牛蒡苷22.73 μg/mL、汉黄芩苷9.141 μg/mL、黄芩素2.618 μg/mL 的70% 甲醇溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算回收率。测得葛根素、连翘酯苷A、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷、黄芩素平均加样回收率分别为 98.8%、101.0%、100.0%、99.4%、98.9%、101.4%，RSD 分别为1.6%、1.3%、1.2%、0.74%、0.58%、1.2%。

2.9 样品含有量测定 取6 批颗粒，每批3 份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 成分选择 本实验考察了小儿解表颗粒另一君药金银花中绿原酸，通过查阅文献［12-13］和预实验发现它在牛蒡子、蒲公英中也能检出，不具有专属性，故未纳入分析；连翘中连翘苷含有量低，均匀性差，故选择另一指标性成分连翘酯苷A进行测定。

3.2 检测波长选择 本实验采用DAD 检测器在200～400 nm 范围内进行全波长扫描，并采集光谱图。结果，葛根素、连翘酯苷A、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷、黄芩素分别在250、326、278、278、276、276 nm 处有最大吸收，故选择250 nm作为葛根素检测波长，326 nm 作为连翘酯苷A 检测波长，278 nm 作为黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷、黄芩素检测波长。

3.3 色谱条件优化 本实验考察了Agilent ZORBAX SB-C18、Waters Symmetry-C18、Thermo Hypersil Gold-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），发现Waters Symmetry-C18色谱柱分离效果最好，色谱峰对称性理想。再考察了流动相乙腈-水、乙腈-0.1% 乙 酸、乙 腈-0.1% 磷 酸、乙 腈-0.2% 磷酸［14-15］，发现乙腈-0.2% 磷酸洗脱时各成分分离度、色谱峰对称性良好。最终，确定为“2.1”项下色谱条件。

3.4 含有量分析 表3 显示，6 批小儿解表颗粒样品中各成分含有量差异较大，除了不同生产企业之间（如连翘酯苷A 相差近6 倍）外，同一生产企业不同批次之间也是如此，如黄芩素相差近3倍。其原因可能是不同批次原料药差异所致，需引起厂家关注。