原料配比对胆南星成分及药效影响

李泽煜，潘 多，单国顺，许 枬，高 慧，贾天柱

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

2017 年药智网公布连续3 年抽查发现9 个厂家的胆南星不合格，其中5 家属假冒，胆南星质量问题可见一斑。胆南星的炮制工艺为制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成，或用生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵而成，实际生产以后者居多［1］。传统理论非常重视胆南星的胆汁用量。如《本草》 言，“其功如牛黄者，即胆汁之精华耳”［2］。《药品化义》 曰，“胆星，意不重南星而重胆汁，借星以收取汁用，非如他药监制也，故必须九制则纯。假胆以清胆气，星以豁结气，大能益肝镇惊”［3］。现代研究发现胆南星抗惊厥和抑制中枢兴奋作用强弱与胆汁的用量有关［4］。但因活性成分不清楚，原料配比对胆南星药效作用影响研究不够深入，实际生产中胆汁配比不足是导致胆南星质量问题的主要原因［5］。为深入揭示原料配比对胆南星的成分和功效的影响，提高胆南星质量，本研究采用6 种成分为指标［6-7］，考察不同胆汁配比对胆南星成分的影响。同时，依据功效和临床主治症，选择大鼠酵母致热实验、小鼠气管段酚红法和小鼠氨水引咳实验考察胆汁配比对胆南星药效的影响，以期为规范胆南星生产工艺提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 cquity 超高效液相色谱分析系统、TSQ 三重四级杆质谱仪（美国Waters 公司）；jnt-lgj型电子体温计（北京翼诺泰科技发展有限公司）：UX4200S 型电子天平（上海衡发实业有限公司）；Victor X5 型酶标仪（美国Perkin Elmery 公司）；大鼠IL-1β ELISA 试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司，S20171219HF）；大鼠IL-6 ELISA 试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司，S20171213SD）；大鼠TNF-α ELISA 试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司，S20171208GY）；UV-752 型紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.2 试药 胆南星，取采集于辽宁千山地区，经辽宁省药品检验所王维宁主任药师鉴定为东北天南星Arisaema amurenseMaxim.的干燥块茎，粉碎，按文献［3］方法，分别加入1/3 倍量猪胆汁、1倍量猪胆汁、3 倍量猪胆汁，制成胆南星，平行3份。布洛芬片（规格0.1 g/片，由吉林万通药业集团郑州万通复升药业股份有限公司生产，国药准字H41025653）。酵母菌（安琪酵母股份有限公司，批号20161212）。磷酸可待因（青海制药厂有限公司，批号20100110）；氯化铵片（北京中新制药厂，批号120901）。牛磺鹅 去氧胆酸（批号100078-200414A）、牛磺猪去氧胆酸（批号100078-200414）、鹅去氧胆酸（批号 100078-200414）、猪去氧胆酸（批号100078-200414）购自中国食品药品检定研究院；甘氨鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸由本实验室提供，质量分数达98%。

1.3 实验动物 SPF 级3 月龄雄性SD 大鼠，体质量200～220 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号：SCXX（辽）2016-0001。

2 方法与结果

2.1 LC-MS 法测定胆南星中6 种胆汁酸成分

2.1.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0 min，35%A；2 min，45%A；10 min，48%A；11 min，100%A）；柱温35 ℃；体积流量0.40 mL/min；进样量5 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾负离子模式，毛细管电压3.0 kV；脱溶剂气流N2；体积流量900 L/h；脱溶剂温度450 ℃；锥孔气流N2；体积流量50 L/h；离子源温度150 ℃；碰撞气体氩气。采用MRM 定量模式，6 种分析物的质谱分析条件参数见表1，总离子流图见图1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 MS parameters of various constituents

图1 各成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

2.1.3 混合对照品制备 精密称取对照品适量，加甲醇制成单一对照品溶液，作为贮备液。分别吸取各单一对照品贮备液1.0 mL，置于100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成含猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸分别为8.78、16.88、6.24、19.73、27.18、21.97 μg/mL 的混合对照品溶液。内标液为绿原酸，质量浓度为5 μg/mL。

2.1.4 供试品溶液制备 精密称取胆南星粉末0.2 g，置具塞三角瓶中，加甲醇5 mL，密塞，精密称定质量，超声处理（250 W，50 kHz）30 min，放冷，称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 线性关系考察 分别准确取“2.1.3”项下各对照品贮备液适量，用甲醇稀释，配制系列梯度质量浓度的对照品混合溶液，测定前按1∶1加入内标。依法测定峰面积，以峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标（Y），分析物质量浓度为横坐标（X）进行回归，得到回归方程和相关系数，并以信噪比为10 计算定量限（LOQ），以信噪比为3计算检测限（LOD），结果见表2。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.5.2 稳定性试验 精密称取编号SCFZ-1 样品0.2 g，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测得样品中猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸的RSD 分别为4.79%、2.09%、1.86%、2.25%、2.66%、2.57%。表 明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.5.3 精密度试验 吸取混合对照品溶液，在“2.1.1”项条件下，日内重复测定6 次，连续测定3 d，测得猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸的日内精密度RSD 分别为0.85%、1.5%、1.16%、0.80%、0.51%、1.30%，日间精密度RSD 分别为2.43%、1.98%、1.96%、1.53%、2.52%、3.34%，表明该仪器精密度良好。

2.1.5.4 重复性试验 分别精密称取编号为SCFZ-1 的胆南星粉末6 份，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项条件下进样，测得样品中猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸含有量 RSD 分别为3.54%、3.77%、3.43%、4.09%、4.25%、3.06%，表明该方法重复性良好。

2.1.5.5 加样回收率试验 精密称取与重复性试验同批次已知含有量（编号SCFZ-1）的胆南星样品9 份（每份0.1 g），精密加入低、中、高3 个质量浓度的6 种对照品溶液，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项条件下进样测定，计算加样回收率。得猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸平均加样回收率分别为99.7%、99.6%、99.3%、99.5%、99.6%、99.3%，RSD 分别为 1.01%、1.07%、1.88%、1.57%、1.94%、1.64%。

2.1.6 样品含有量测定 称取3 种不同原料配比的胆南星粉末，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，分别吸取混合对照品溶液及供试品溶液各2 μL，在“2.1.1”项条件下进样，测定峰面积，计算样品中猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸的含有量，结果见表3。

2.2 解热作用研究

2.2.1 受试药物配制 取不同原料配比胆南星，加80%乙醇提取2 次，每次提取1 h，滤过，合并滤液，回收溶剂，浓缩成1.02 g/mL 的药液，置于冰箱备用。

2.2.2 大鼠酵母致热实验 大鼠适应性饲养7 d，从第8 天开始每天测量肛温2 次，时间间隔为0.5 h，将连续3 d 体温小于38 ℃和大于36 ℃，以及2 次温差＞0.5 ℃的大鼠剔除。实验当天，连续测量体温2 次，间隔0.5 h，将2 次温度的平均值作为基础体温。同时，剔除体温大于38 ℃者。剩余大鼠随机分成6 组，即正常对照组、模型组、布洛芬组、高比胆南星组（胆汁占原料比为3∶1）、中比胆南星组（胆汁占原料比为1∶1）、低比胆南星组（胆汁占原料比为1∶3），每组8 只。实验前大鼠禁食不禁水12 h，正常组大鼠背部皮下注射无菌生理盐水，其余各组大鼠背部皮下注射10% 酵母菌10 mL/kg［8］。造模5 min 后，布洛芬组给药剂量为20 mg/kg，各受试药物组分别灌胃给予相应的胆南星药液1.7 g/kg。正常组与模型组大鼠灌胃给予同体积生理盐水。分别于给药后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 测量体温，每个时间点连续测量2 次。最后1 次测定体温后，麻醉取血，分取血清，用于IL-1、IL-6、TNF-α 含有量测试。

2.3 祛痰作用

2.3.1 小鼠气管酚红排泄实验 参照文献［9］方法，采用小鼠气管段酚红法分别对3 种不同原料配比胆南星的80%醇提取物进行药效学评价。每组均为10 只小鼠，雌雄各半。昆明种小鼠适应1周，实验分组同“2.2.2”项，实验前小鼠禁食不禁水12 h，正常组灌胃给予蒸馏水，阳性药物组灌胃给予氯化铵1 g/kg，给药组分别灌胃给予3 种胆南星醇提取物，给药量10 mL/kg，1 次/d，连续5 d。末次给药30 min 后，各组小鼠腹腔注射5%酚红生理盐水溶液（10 mL/kg）0.2 mL，45 min后将小鼠麻醉处死，将其仰位固定于手术板上，剪开颈正中皮肤，分离气管，剪取自甲状软骨处至气管分叉处的气管段，取出气管后，放入盛有2 mL生理盐水的试管中，超声15 min，加入5%NaHCO3溶液2 mL，置紫外分光光度计下558 nm处测吸光度（A）。

2.3.2 酚红标准曲线绘制 精密称取研磨过的酚红粉末2.50 mg，置于50 mL 量瓶中，用生理盐水溶解并定容，配制成50 μg/mL 酚红溶液，用移液管精密吸取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL 该溶液于10 mL 量瓶中并用生理盐水定容，分别加入5% NaHCO3溶液1.00 mL，在紫外分光光度计558 nm 处测定A值，以吸光度为纵坐标（A），溶液中酚红的质量浓度为横坐标（C）进行回归，得回归方程A=0.1634C-0.001 7（r=0.999 3）。表明酚红溶液在0～30 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.4 止咳作用实验 参照文献［10］方法，采用浓氨水刺激小鼠黏膜引咳实验，分别对不同原料配比胆南星80%乙醇提取物进行药效学评价。实验分组同“2.2.2”项，随行设置正常对照组和阳性药组。昆明种小鼠适应饲养3 d，实验前小鼠禁食不禁水12 h。对照组灌胃给予含2 滴1%聚山梨酯-80 的0.5% CMC-Na，阳性药物组灌胃给予磷酸可待因30 mg/kg，给药组分别灌胃给予3 种胆南星的醇提取物，1 次/d，连续7 d。末次给药1 h 后，分别将小鼠按照分组顺序放置于倒置的500 mL 容器中，内放一棉球，用1 mL 注射器吸取25%氨水0.3 mL 注入棉球，迅速倒置容器（以防气体泄漏），秒表记录时间，观察记录小鼠的咳嗽潜伏期（从记录时间起到小鼠第1 次咳嗽的时间）、3 min内咳嗽次数（以小鼠腹肌收缩，张大口同时并伴有咳嗽声为准），计算抑咳率。抑咳率%=（对照组咳嗽次数-给药组咳嗽次数）/对照组咳嗽次数。

2.5 统计分析 运用SPSS 17.0 软件进行计量资料分析，数据符合正态分布采用单因素方差分析，结果用（）表示。

2.6 3 种原料比例胆南星中胆汁酸成分含有量 结果见表3。表明不同原料比例胆南星中胆汁酸含有量差异较大，尤其是结合型胆汁酸比例差异更加显著。

表3 不同原料比例样品中6 种成分含有量测定结果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of six constituents in different ratio samples（n＝3）

2.7 解热作用比较

2.7.1 对干酵母致热大鼠体温变化的影响 图2显示，造模后模型组大鼠平均体温逐渐升高，7 h达到峰值，随后开始下降。各受试药物组大鼠平均体温上升幅度均小于模型组，尤其是造模5 h之后差异显著（P＜0.01）。高比胆南星组和中比胆南星组的解热作用强于低比胆南星组组（P＜0.05）。

图2 各组大鼠平均体温变化曲线Fig.2 Change curve of average body temperature of rats in each group

2.7.2 对致热大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含有量的影响 表4 表明，给药10 h 后，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含有量上升（P＜0.01）。与模型组比较，布洛芬组、高比胆南星组和中比胆南星组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含有量均下降（P＜0.01），但低比胆南星组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含有量无降低（P＞0.05）。

表4 不同来源样品对干酵母致热大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含有量的影响（，n＝8）Tab.4 Effects of samples from different sources on the contents of IL-1β，IL-6 and TNF-α in serum of rats induced by dry yeast（，n＝8）

表4 不同来源样品对干酵母致热大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含有量的影响（，n＝8）Tab.4 Effects of samples from different sources on the contents of IL-1β，IL-6 and TNF-α in serum of rats induced by dry yeast（，n＝8）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，∗∗P＜0.01。

2.8 祛痰作用比较 实验结果表明，不同胆汁用量的胆南星祛痰作用有一定差异，结果见表5。与对照组比较，氯化铵组、3 种胆南星组均能增加小鼠酚红排泌量（P＜0.01）；高比胆南星组和中比胆南星的祛痰作用强于低比胆南星组。

表5 不同原料比例样品祛痰作用比较（，n＝10）Tab.5 Comparison of phlegm removing effects of samples made by different ratio raw materials（，n＝10）

表5 不同原料比例样品祛痰作用比较（，n＝10）Tab.5 Comparison of phlegm removing effects of samples made by different ratio raw materials（，n＝10）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与低比胆南星组比较，#P＜0.05。

2.9 止咳作用比较 不同胆汁用量的胆南星止咳作用差异较小，结果见表6。与对照组比较，磷酸可待因组、及3 种胆南星各组均能延长小鼠咳嗽潜伏期，减少小鼠3 min 内咳嗽次数（P＜0.05，P＜0.01），但3 种受试药物组间无统计学差异。

表6 不同原料比样品止咳作用比较（，n＝10）Tab.6 Comparison of arresting cough effects of samples made by different ratio raw materials（，n＝10）

表6 不同原料比样品止咳作用比较（，n＝10）Tab.6 Comparison of arresting cough effects of samples made by different ratio raw materials（，n＝10）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01。

3 讨论

实地调查发现，有厂家生产胆南星时胆汁占原料比甚至低于40%。故结合传统工艺和实际生产，本研究以胆汁占原料配比为3∶1、1∶1、1∶3 分别制备胆南星，考察原料配比对胆南星成分和药效的影响。并基于胆南星的清热化痰功效及其临床常用于治疗小儿高热惊风症以及痰热咳嗽等症［3］，选择解热、止咳、化痰作用进行药效评价。

不同胆汁配比的胆南星中6 种胆汁酸含有量差异较大，尤以结合型胆汁酸更为显著，这与胆汁中富含胆汁酸类成分相吻合［11-12］。IL-1β 是重要的致热细胞因子［13］，IL-6 是多种发热的中间物质，TNF-α 是一种重要的内源性致热原［14］。从酵母致热大鼠给药后炎症因子的变化可见，不同原料配比胆南星的解热作用差异可能与其调节IL-1β、IL-6和TNF-α 炎症因子分泌量变化有关。药效学实验结果显示，胆汁用量大，则胆南星的解热、祛痰作用良好，反之作用减弱，但对止咳作用影响较小。结合胆汁酸具有解热、祛痰和止咳等作用，表明胆汁用量与胆南星的功用关系密切。依据药效实验结果，胆南星的胆汁用量与天南星的比值不应低于1∶1。本研究只是做了初步的胆汁酸成分与药效作用的比较，原料配比对其他成分及活性影响还需进一步深入研究，从而为胆南星质量控制提供更充分依据。