利肺片对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的影响

陈 霞，刘 丹，段娟娟，李晋生，张晓笛，何丽娟，黄 倩，张瀚涛，顾海鸥

［1.北京中研同仁堂医药研发有限公司，北京 100079；2.北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，北京 100079；3.中国北京同仁堂（集团） 有限责任公司，北京 100079］

流行病学调查发现，慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）在我国总人群发病率为8.6%，其中40 岁以上人群中发病率高达13.7%［1］，已成为我国严重威胁人民群众健康的重大慢性疾病。因此，探索有效的治疗药物及方案已成为研究的焦点。COPD 的发病机制是多因素参与的结果，至今尚未完全阐明。西医在控制COPD 急性发作及感染方面，目前优势突出，但治疗上仍局限于对症处理。中医药在治疗该病有其独特的辨证优势，擅长多靶点多层次整体调节，具有治则治法丰富，疗效稳定，不良反应少等独特优势。所以研究挖掘治疗该病确切有效的中成药已经成为COPD 防治研究的重要策略。利肺片具有驱痨补肺、镇咳化痰之功效，用于肺痨咳嗽、咯痰、咯血、气虚哮喘、慢性支气管炎等。有文献报道和临床实际应用过程中发现利肺片对COPD 具有一定的治疗作用。因此本研究开展了相应的药效学研究，以期进一步明确药物治疗COPD 的效应机制。

1 材料

1.1 动物 Wistar 大鼠，SPF 级，雄性，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。生产许可证号SCXK（京）2012-0001。

1.2 试剂与药物 利肺片（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号15122182）。氨茶碱（石药集团欧意药业有限公司，批号040150304）；固本咳喘片（精华制药集团股份有限公司，批号23151102）；脂多糖（美国Sigma 公司，批号064M4125V）；SOD（批号20160902）、MDA（批号20160901）、NO 试剂盒（批号20160820）购自南京建成生物工程研究所；MMP-9 ELISA 试剂盒（美国Cusabio 公司，批号C07031593）。

1.3 仪器 AniRes 动物肺功能仪（北京贝兰博科技有限公司）；Epoch2 酶标仪（美国BioTek 公司）。ADVIA2120i血液分析仪（德国Siemens 公司）。自制烟熏箱（60 cm×60 cm×70 cm），由有机玻璃制成。

2 方法

2.1 造模、分组、给药 Wistar 大鼠，雄性，105 只，适应性喂养9 d，随机分为空白组、模型组、氨茶碱组（0.06 g/kg）、固本咳喘片组（0.36 g/kg）及利肺片高、中、低剂量组（0.3、0.15、0.075 g/kg）。造模方法参照文献［2］略加改动，造模组大鼠在第1 天和第14 天用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，快速向气管内注入1 mg/mL的脂多糖溶液，每只0.2 mL，然后将大鼠固定板竖立旋转，左右摇晃约30 次，使脂多糖溶液能够均匀分布于两肺，空白组大鼠注入生理盐水。烟熏（插管日不烟熏），实验第2～13 天及第15～60 天将造模组大鼠放入自制烟熏箱内给予烟熏，每次15 只大鼠，10 支香烟/次，2 次/d，30 min/次。空白组大鼠不烟熏。在模型复制过程中，有20只造模大鼠死亡，模型制备的成功率为77.8%。各给药组分别灌胃给予相应的药物，1 次/d，连续给药4 周；空白组和模型组灌胃给予同体积蒸馏水。

2.2 测定大鼠肺功能 末次给药后用AniRes 动物肺功能分析系统检测大鼠肺功能（FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF）。

2.3 检测血清NO、MDA、SOD 水平 腹主动脉取血，离心取血清，按照试剂盒说明书测定血清中NO、MDA、SOD水平。

2.4 检测炎症细胞分类计数 对大鼠左侧肺叶用冰生理盐水2 mL 进行灌洗，用ADVIA2120i 血液分析仪进行炎症细胞分类计数。

2.5 检测MMP-9 水平 采用ELISA 法。取出右肺叶迅速放入液氮中，用以测定肺组织中MMP-9 水平。

2.6 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计学软件进行分析，数据以（）表示，进行方差齐性检验。方差齐采用方差分析；方差不齐采用非参数检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般生长状态 空白组大鼠身体毛发白有光泽，无烦躁不安，呼吸平稳均匀，鼻头湿润没有喘促，食量及饮水稳定，活动正常，排便正常，体质量增长迅速。其余各组大鼠在整个造模过程中，动物表现由开始的烦躁不安转为精神萎靡不振。随着造模过程的推移，动物身体毛发逐渐枯槁、发黄、无光泽，呼吸急促、喘息、腹式呼吸加重，鼻头日渐发绀、分泌物较多，饮水增加，活动减少，喜拱背蜷缩，喜扎堆聚集，体质量明显减轻。给药3 周后，给药组较模型组体质量明显增加，症状明显改善。见表1。

表1 利肺片对COPD 模型大鼠体质量的影响（）

表1 利肺片对COPD 模型大鼠体质量的影响（）

注：与空白组比较，#P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.01。

3.2 大鼠肺功能 与空白组比较，模型组大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF 降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，利肺片高、中剂量组升高FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF（P＜0.05，P＜0.01）；利肺片低剂量组升高MMF、PEF（P＜0.05）。提示利肺片能较好地改善COPD 肺功能。见表2。

表2 利肺片对COPD 模型大鼠肺功能的影响（）

表2 利肺片对COPD 模型大鼠肺功能的影响（）

注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

3.3 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平 与空白组比较，模型组大鼠血清SOD、NO 水平降低（P＜0.01），血清MDA水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，利肺片高、中、低剂量组可 升高大 鼠血清SOD、NO 水平（P＜0.05，P＜0.01），利肺片高、中剂量组可降低大鼠血清MDA 水平（P＜0.05）。见表3。

表3 利肺片对COPD 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平的影响（）

表3 利肺片对COPD 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平的影响（）

注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

3.4 大鼠肺灌洗液中炎症细胞 与空白组比较，模型组大鼠肺灌洗液中WBC 总数、淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞数量升高（P＜0.01）；与模型组比较，利肺片高、中、低剂量组大鼠肺脏灌洗液中WBC 总数、淋巴细胞、巨噬细胞数量降低（P＜0.01）。利肺片可改善COPD 模型大鼠肺脏组织炎性细胞浸润，具有一定的抗炎作用。见表4。

表4 利肺片对COPD 模型大鼠肺脏灌洗液中炎症细胞分类计数的影响（）

表4 利肺片对COPD 模型大鼠肺脏灌洗液中炎症细胞分类计数的影响（）

注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

3.5 大鼠肺组织中MMP-9 水平 与空白组比较，模型组大鼠肺组织中MMP-9 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，利肺片高、中、低剂量组可降低大鼠肺组织MMP-9 水平（P＜0.01）。由此可见利肺片具有明显缓解COPD 大鼠蛋白酶/抗蛋白酶失衡的作用。见表5。

表5 利肺片对COPD 大鼠肺组织中MMP-9 水平的影响（）

表5 利肺片对COPD 大鼠肺组织中MMP-9 水平的影响（）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，∗∗P＜0.01。

4 讨论

COPD 是以持续的气流受限为主要特征，并呈进行性发展的一种常见的慢性呼吸道疾病，最终发展为肺心病和呼吸衰竭慢性疾病。COPD 临床表现为慢性咳嗽、咳痰、气短或呼吸困难、喘息和胸闷等症状，在中医学中其被归属于“喘证”“气短”“痰饮”“咳嗽”“哮证”“肺胀”等病范畴［3］。其最根本的原因是机体虚弱、抵抗力低下，尤其是肺脾肾三脏之虚，成为COPD 反复发作的核心。利肺片由百部、百合、五味子、枇杷叶、白及、牡蛎、甘草、冬虫夏草、蛤蚧粉配伍而成。本方为治肺肾两虚、气失摄纳之咳嗽、咯血、哮喘等症的常用有效成药。方中五味子酸温而润、上敛肺气、下滋肾阴，有止咳平喘之效，冬虫夏草既补肾阳，又益肺阴，且可止血化痰，蛤蚧补肺肾，定喘止嗽，百合甘而微寒，清肺润肺而止咳，诸药补肺敛气、益精血而止血共为主药；枇杷叶、百部化痰止咳、祛痨杀虫为辅药；白及收敛止血，牡蛎收敛固涩为佐药；甘草补益肺肾、调和诸药为使。全方攻补兼施、扶正驱邪，具有补肺益肾、止咳化痰之功［4］。文献报道利肺片对COPD 急性发作期和稳定期患者均有一定的治疗作用［5］。80 例COPD 急性发作住院患者口服利肺片辅助治疗后，能明显降低CAT 评分改善患者临床症状、提高动脉血氧分压和肺功能，具有治疗急性发作期COPD 的作用［6］。辛大永［7］观察利肺片治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期的临床观察80 例，治疗28 d 后利肺片能明显改善COPD 稳定期患者的咳喘症状和肺功能，提高生活质量。同时，利肺片有明显的镇咳、平喘、祛痰的作用［8］。由此推测利肺片对COPD有一定的治疗作用。

肺功能检查是诊断COPD 的金指标，也是判断气流受限的主要客观指标，1 秒用力呼气容积与用力肺活量比值百分数（FEV1/FVC%）是评价气流受限和COPD 严重程度的最敏感指标，因为大鼠的呼吸频率比人快，所以本研究选择FEV0.3/FVC% 来代表FEV1/FVC%。用力最大呼气流速（PEF）能够反映气道有无阻塞。最大呼气中期流速（MMF）主要取决于用力肺活量非用力部分，该指标反应小气道阻塞情况。研究发现COPD 模型大鼠FEV0.3/FVC%、MMF、PEF 显著降低，表明该模型大鼠气道阻力明显增高，气流受限，存在阻塞性通气障碍，而利肺片可显著升高COPD 模型大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC%、PEF、MMF，使其气流受限得到改善，具有显著改善肺功能的作用。

无论在COPD 的发病起始还是在COPD 的整个病程中，炎症一直被认为是最重要的机制。有害颗粒物（包括烟雾、细菌等微生物）进入肺内激活体内的炎症反应系统，从而释放出多种炎性介质、蛋白酶类（如MMP-9 等）和大量氧自由基和氧化产物（如MDA 等），造成体内蛋白酶/抗蛋白酶失衡和氧化/抗氧化失衡，使肺细胞外基质过多破坏降解，弹性纤维断裂，促进肺组织破坏以及气道的重塑导致气流受限［9］，从而促进COPD 的发生和发展［10-11］。本研究中COPD 模型大鼠肺脏灌洗液中炎性细胞明显增加，而利肺片能显著降低COPD 模型大鼠肺脏灌洗液中白细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的数量，具有改善肺组织炎性细胞浸润的作用。MDA 是脂质过氧化代表产物之一，可反映氧化应激的严重程度。SOD 是机体内重要的抗氧化剂，其氧化活性代表了体内抗氧化能力的高低［11-12］。COPD 模型大鼠血清中MDA 水平明显升高，SOD 活性和NO 水平显著降低，体内氧化/抗氧化明显失衡，利肺片可显著升高COPD模型大鼠血清SOD 活性、NO 水平，并下调模型大鼠血清中MDA 水平，具有明显的抗氧化作用，对抗COPD 模型大鼠体内的氧化/抗氧化失衡。MMP-9 是降解细胞外基质的主要酶类，可增加气道高反应性和组织损伤，促进气道重塑，导致气流阻塞［13］，利肺片能明显降低COPD 模型大鼠肺组织中MMP-9 含有量，从而对抗蛋白酶/抗蛋白酶失衡，发挥治疗的作用。

由此可见，利肺片具有较好的改善COPD 肺功能的主要药效学作用，其中抗炎、抗氧化、下调肺组织中MMP-9含量可能是药物治疗COPD 效应机制的关键环节。其作用机制有待于进一步研究。