清宣止咳颗粒对咳嗽大鼠抗炎和免疫调节的影响

乔 燕，朱潇潇，吴建元，吴 娟，张兴德

（南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023）

咳嗽是比较常见的临床症状，多由呼吸系统疾病引起，是学龄前期及学龄期儿童比较常见的疾病。咳嗽的主要发病机制与细胞免疫失衡、气道慢性炎症的形成有关［1］。目前，临床上针对咳嗽只能对症处理，小剂量激素、抗生素、镇咳药是比较常用的药物［2］。但以上药物的维持时间较为短暂，容易造成病情反复，而且西药的不良反应也时有报道。中医药注重标本兼治，在治疗咳嗽方面积累了大量的经验。清宣止咳颗粒是小儿外感风寒咳嗽的一种常用药，处方来源于我国第一批国家级名老中医张珍玉教授多年临床行之有效的经验方，已经被大量文献报道在改善咳嗽临床症状方面有较好的疗效［3-4］。但目前有关清宣止咳颗粒药物作用机制的研究较少。选取清洁级Wistar 大鼠为研究对象，通过清宣止咳颗粒来干预咳嗽模型大鼠，探讨清宣止咳颗粒的抗炎和免疫作用。

1 材料

1.1 动物 50 只清洁级Wistar 大鼠（生产许可证号SCXK（沪）2018-0007），健康雄性，体质量180～220 g，于研究院动物饲养室饲养，清洁Ⅱ级，室温18～22 ℃，相对湿度50%。

1.2 试剂与药物 清宣止咳颗粒（江苏苏中药业集团股份有限公司，国药准字Z1999066，10 g/袋，5 袋/盒），由桑叶、杏仁、薄荷、桔梗、白芍、陈皮、枳壳、紫菀、甘草九味中药组成。10% 水合氯醛（美国Sigma 公司，货号47335-U MSDS）；LPS（美国Sigma 公司，货号L2630 MSDS）；辣椒素（美国Sigma 公司，货号M1022 MSDS）；10%中性福尔马林（美国Sigma 公司，货号47083-U MSDS）；IL-4 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E04 635 r）；IL-8 试剂盒（美国Kamiya Biomedical 公司，货号KT-60204）；TNF-α 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E11987r）；IgE 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E07984r）；LTC-4 试剂盒（上海远慕生物科技有限公司，货号YM-2978B）；IFN-γ 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E04579r）。

2 方法

2.1 造模 将所有大鼠适应性饲养1 周后，随机分为空白组、模型组、清宣止咳颗粒低、中、高剂量组。清宣止咳颗粒组建立咳嗽模型，参照相关文献中的造模方案［5］。将大鼠放入1 m3的染毒箱内进行香烟烟雾暴露，以锯屑末50 g 加10 只香烟点燃烟熏，1 次/d，熏烟40 min/次，连续12 d。大鼠在此期间自由饮水进食。每日观察记录大鼠的一般状况，包括体质量、呼吸、进食水量、肛温、精神状况、毛发等。第13、16、19 天采用10%水合氯醛麻醉后，将0.4 mg/mL 的LPS 溶液滴入大鼠的鼻腔，滴入量以10 μL/g 计算。第14、15、17、18、20 天将大鼠置于透明密闭容器中雾化吸入的辣椒素溶液（1×10-4mol/L）3 min进行激发，观察2 min，1 次/d。观察各组大鼠的状态。当大鼠出现呼吸加深、加快、急促、咳嗽，鼻部湿润，行动呆滞或俯伏不动等表现时提示造模成功。于造模第19 d 开始灌胃干预。

2.2 分组、给药 造模成功后清宣止咳颗粒组采用清宣止咳颗粒药物灌胃，清宣止咳颗粒低、中、高剂量组给药剂量分别为清宣止咳颗粒0.75、1.5、3.0 g/kg 以原药计算［6］，灌药体积为10 mL/kg；模型组给予同等体积的生理盐水灌胃，灌胃1 次/d，连续给药15 d。

2.3 HE 染色 将所取得的大鼠的鼻窦组织经10%中性福尔马林浸泡后采用石蜡包埋，制作切片，厚度为4 μm。烤干后对相应的切片编号，光学显微镜下观察大体组织病变和炎症细胞浸润情况。

2.4 血液指标的检测 取大鼠的腹主动脉血，离心机离心分离血清后进行指标的检测。炎性因子指标包括白IL-4、IL-8、TNF-α，免疫调节因子指标包括IgE、LTC-4、IFN-γ，以上指标均采用ELISA 法测定。严格按照试剂盒的操作说明进行。以上实验过程的指标检测均由南京医科大学实验动物中心获得。

2.5 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件，计量资料采用（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用方差分析，以P≤0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠的一般状态 造模前各组大鼠的体质量均衡，进食饮水、呼吸、肛温等基本一致，无显著性差异。空白组大鼠毛发有光泽、呼吸平稳、行动灵活、粪便正常。模型组和清宣止咳颗粒组的大鼠造模后毛发不荣，眼睛无神，烦躁不安、呼吸急促、咳嗽喘息、消瘦、活动减少。模型组小鼠体质量增长缓慢，清宣止咳颗粒组随着干预时间的延长，咳嗽、咳喘症状逐渐减轻，饮食、饮水、行为活动趋于正常。实验期间模型组大鼠死亡2 只，清宣止咳颗粒低剂量组死亡1 只大鼠。

3.2 大鼠鼻窦黏膜组织HE 染色 空白组大鼠鼻窦黏膜上皮完整，管腔未扩大，无明显增生和坏死，黏膜下层未见炎性细胞浸润。模型组的鼻窦黏膜上皮细胞变性严重（渗出、水肿、出血），黏膜下层可见大量炎性细胞浸润，纤毛变性坏死脱落。清宣止咳颗粒组的大鼠鼻窦黏膜上皮细胞增生，部分纤毛变性，黏膜下层可见少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠鼻窦黏膜组织HE 染色（×40）

3.3 大鼠的炎症因子水平 与空白组比较，模型组IL-4、IL-8、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，清宣止咳颗粒高剂量组IL-4、IL-8、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。见表1。

表1 清宣止咳颗粒对大鼠的炎症因子的影响（）

表1 清宣止咳颗粒对大鼠的炎症因子的影响（）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

3.4 大鼠免疫调节水平 与空白组比较，模型组IgE、LTC-4 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，清宣止咳颗粒高剂量组IgE、LTC-4 水平降低，IFN-γ水平升高（P＜0.05）。见表2。

表2 清宣止咳颗粒对大鼠的免疫调节指标的影响（）

表2 清宣止咳颗粒对大鼠的免疫调节指标的影响（）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，# P＜0.05。

4 讨论

咳嗽常急性起病，反复发作，治疗起来具有一定的难度。目前多数学者都认为咳嗽与多种炎症细胞、炎性介质、细胞因子共同参与的气道高反应性有关［7］。临床上对咳嗽多以对症治疗为主，临床应避免继发细菌感染。但西药治疗具有反复发作及突发性表现，应用中成药最佳。中成药制剂具有多靶点，能够调理患儿的机体、提高全面免疫力，减少反复发作。清宣止咳颗粒是一种纯中药制剂，由桑叶、杏仁、薄荷、桔梗、白芍、陈皮、枳壳、紫菀、甘草九味中药组成，独具用药风格，药均温润、不寒不热，药性温和，以轻宣为主，不伤稚阴及脾胃。该中成药可宣肺止咳、祛风解痉，对小儿常见的咳嗽咳痰、鼻塞流涕、咽痛咽痒以及发热等都有较好的疗效。清宣止咳颗粒具有镇咳、祛痰、抗炎的药理作用［3］，能够养血护肺，在不引起2 次损伤的情况下，修复现有损伤。

本研究通过清宣止咳颗粒干预咳嗽大鼠模型，探讨作用机制。结果显示，清宣止咳颗粒能够显著减轻咳嗽大鼠的鼻窦黏膜上皮的病理表现，鼻窦黏膜上皮细胞无明显的坏死，伴少量的淋巴细胞浸润。对大鼠腹主动脉炎症因子和免疫调节因子检测发现，清宣止咳颗粒高剂量组大鼠的IL-4、IL-8 及TNF-α 均显著低于模型组（P＜0.05）。IL-4、IL-8 及TNF-α 属于比较常见的炎性因子，在气道炎症反应中发挥着重要的作用。其中IL-4 可影响T 细胞分化，启动和维持炎症反应，促进IgE 的合成与分泌，嗜酸细胞的浸润和激活［8］。IL-8 可趋化和激活中性粒细胞、T 淋巴细胞，释放炎性介质，加重气道炎症，导致气道平滑肌肥大增，引起气道黏膜水肿。TNF-α 是巨噬细胞分泌的肽类炎性介质，可刺激蛋白溶解酶、氧自由基的大量释放，诱导各种细胞因子的产生，使中性粒细胞黏附和聚集，改变气道产生炎性，增高气道反应性［9］。模型组的IL-4、IL-8 及TNFα 较空白组显著上升，表明以上因子与气道炎症的形成关系及气道高反应有关。本研究结果还显示，清宣止咳颗粒高剂量组的IgE、LTC-4 低于模型组，IFN-γ 高于模型组（P＜0.05）。IgE 是一种免疫球蛋白，可参与肥大细胞和嗜酸性粒细胞的免疫功能，属于过敏反应的介导物质。LTC-4是体内白三烯的主要组成部分，参与气道高炎症反应的多个环节，可导致炎症细胞在气道内大量聚集［10］。IFN-γ 是一种保护性免疫调节因子，能够增加宿主的防御能力［11］。模型组IgE、LTC-4 显著升高，IFN-γ 显著降低，而清宣止咳颗粒则改善了这种状态，这说明清宣止咳颗粒可通过调节三者的血清含有量，达到调节集体免疫功能紊乱，抑制或阻断气道慢性炎症反应的目的。这可能是清宣止咳颗粒治疗咳嗽的重要作用机制。

综上所述，清宣止咳颗粒能够抑制咳嗽大鼠炎症细胞细胞因子释放，减轻炎症反应，调节免疫异常，这可能是其治疗咳嗽的作用机制。