CTGF mRNA在溃疡性结肠炎组织中的表达及与病情和预后的关系

蒋丽琳 肖南平 杨兴平 郭 娟 蒋 欢 孙传喜

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性炎性疾病，以缓解和复发交替为主要特征，严重影响患者的正常生活[1-2]。目前针对UC的治疗方式主要有药物治疗和外科干预，虽能在一定程度上控制炎性反应，但易复发[3]。因此，干预UC患者炎性反应的发生、发展是治疗的关键，但目前UC的发病机制尚未阐明，且缺乏有效的生物学标志物用以评估UC患者的炎性反应程度及预后。近年来多项研究报道，信使RNA(mRNA)在UC患者的肠道组织、血液中异常表达，参与UC的病理生理过程[4-7]。有研究表明，结缔组织生长因子(CTGF) mRNA可介导细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路，从而调控UC的炎性因子水平及肠道菌群[8]，但目前关于CTGF mRNA与UC患者病情及预后关系的报道较少。本研究选取83例UC患者作为研究对象，检测其UC组织中CTGF mRNA的相对表达量，并分析其与患者病情及预后的关系，以期为UC的治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年2月至2017年4月在广元市第一人民医院就诊的83例UC患者作为研究对象。根据《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[9]对疑似UC患者进行诊断，并最终经组织病理学检查确诊为UC。纳入标准：(1)年龄18～70岁；(2)结肠镜检查至回盲部；(3)首次就诊；(4)就诊前未服用抗炎药物。排除标准：(1)合并急性感染性肠炎；(2)合并恶性肿瘤；(3)合并其他自身免疫性疾病；(4)合并心、肝及肾等脏器功能障碍。另择同期经结肠镜检查并切除结肠息肉的85例患者作为对照组。UC组中男性54例，女性29例，平均年龄(47.66±9.22)岁；对照组中男性48例，女性37例，平均年龄(49.23±8.52)岁。两组患者在性别(χ2=1.299，P=0.254)、年龄(t=1.147，P=0.253)方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。本研究中所有患者均签署了知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集所有患者的年龄、性别、结肠镜表现及病变位置等资料。病变位置根据蒙特利尔分型进行划分，E1为病变部位局限于直肠，未达到乙状结肠；E2为病变累及左半结肠，远离脾曲；E3为广泛病变累及脾曲乃至全结肠。

1.2.2 UCEIS评分及内镜下活动度 根据受累肠段最严重处的血管纹理(0～2分)、出血情况(0～3分)、糜烂和溃疡(0～3分)这3个方面计算UCEIS评分。血管纹理正常计0分，斑片状计1分，完全闭塞计2分。黏膜及肠腔无出血计0分，黏膜出血计1分，轻度计2分，中重度计3分。无糜烂及溃疡计0分，糜烂计1分，浅表性糜烂和溃疡计2分，深部糜烂和溃疡计3分。UCEIS评分为以上3项评分之和，其中内镜下轻、中度活动度为2～6分，内镜下重度活动度为7或8分[10]。

1.2.3 RT-qPCR法检测结肠组织中CTGF mRNA相对表达量 无菌环境下用剪刀将结肠组织剪碎，置于液氮中用研钵研磨。取研磨液置于试管中，4 000 r/min离心15 min，提取上清液。将上清液加入总RNA提取试剂盒(日本TOYOBO公司)中提取总RNA。取2 μg总RNA加入反转录试剂盒(日本TOYOBO公司)中进行反转录反应，然后将反转录产物加入PCR扩增仪中进行扩增，扩增条件为94 ℃ 10 min预变性，然后94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共40个循环。内参为GAPDH，ΔCt=CtCTGF mRNA-CtGAPDH，用 2-ΔΔCt表示CTGF mRNA的相对表达量。PCR引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 预后随访 根据《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[9]对UC患者进行标准化治疗。83例UC患者出院后进行为期2年的电话随访，每月随访1次，随访截止时间为2019年4月30日。若UC患者治疗后未复发则视为预后良好，若治疗后复发、并发中毒性巨结肠、恶变或结肠大出血则视为预后不良[11]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组结肠组织中CTGF mRNA相对表达量的比较

UC组患者结肠组织中CTGF mRNA的相对表达量为1.87±0.19，显著高于对照组(0.46±0.11)，差异有统计学意义(t=58.978，P<0.001)。

2.2 CTGF mRNA与UC严重程度的关系

83例UC患者的UCEIS评分为(4.71±1.81)分，其中内镜下轻、中度活动度患者66例(79.52%)，内镜下重度活动度患者17例(20.48%)。重度活动度UC患者结肠组织中CTGF mRNA的相对表达量为2.07±0.16，高于轻、中度活动度UC患者(1.82±0.16)，差异有统计学意义(t=5.831，P<0.001)。UC患者结肠组织中CTGF mRNA的相对表达量与UCEIS评分呈正相关(r=0.798，P<0.001)，详见图1。

图1 UC患者CTGF mRNA的相对表达量与UCEIS评分的散点图

2.3 CTGF mRNA评价UC患者预后的价值

83例UC患者中50例(60.24%)预后良好，33例(39.76%)预后不良，其中29例(34.94%)复发，1例(1.20%)并发中毒性巨结肠，2例(2.41%)癌变，1例(1.20%)结肠大出血。CTGF mRNA诊断UC患者预后不良的ROC曲线下面积(AUC)为0.925(95%CI：0.844～0.970)，最大约登指数为0.699，cut-off值为1.86，敏感度为93.94%，特异度为76.00%，详见图2。

图2 CTGF mRNA诊断UC患者预后的ROC曲线

2.4 影响UC患者预后的相关因素分析

两组患者在年龄、性别和病变位置方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。预后不良组UCEIS评分>6分和CTGF mRNA相对表达量>1.86占比均高于预后良好组，差异均有统计学意义(P均<0.05)，详见表2。进一步将UCEIS评分和CTGF mRNA相对表达量作为自变量，将UC患者预后作为因变量，分析显示UCEIS评分和CTGF mRNA相对表达量均与UC患者预后密切相关(P均<0.05)，详见表3。

表2 影响UC患者预后的单因素分析/例(%)

表3 影响UC患者预后的多因素Logistic回归分析

3 讨论

肠上皮细胞是机体肠道的物理屏障，肠上皮细胞的紧密连接及功能稳定是对抗外界细菌的可靠屏障[12]。当肠上皮细胞功能调节失衡，机体肠道会发生炎性反应，同时细胞内mRNA的表达将有所改变[13-15]。本研究结果显示，UC组CTGF mRNA的相对表达量高于对照组，提示CTGF mRNA可能参与了UC的发病及进展过程。本研究结果还显示，重度活动度UC患者的CTGF mRNA相对表达量高于轻、中度活动度UC患者，且UC患者结肠组织中的CTGF mRNA相对表达量与UCEIS评分呈正相关，上述结果表明CTGF mRNA相对表达量随UC病情加重而升高，进一步证实了CTGF mRNA参与了UC的发病及进展。梁美兰等[16]的研究结果表明，肠上皮细胞损伤及炎性细胞浸润可促进纤维细胞活化、增殖并合成肠壁细胞外基质(ECM)，在上述过程中CTGF可促进纤维细胞活化及ECM沉积，佐证了本研究结果，即随着UC活动度增加，CTGF mRNA相对表达量升高。本研究ROC曲线分析显示AUC为0.925，表明CTGF mRNA对UC预后评价的价值较高，可辅助评价UC预后。有报道指出CTGF mRNA在肠上皮黏膜细胞炎性损伤进展为纤维化阶段的过程中发挥着重要作用[16]，推测结肠组织中CTGF mRNA的相对表达量可反映UC的预后情况。本研究的多因素Logistic回归分析结果显示，UCEIS评分和CTGF mRNA相对表达量均与UC患者的预后密切相关。

CTGF是即刻早期基因CCN家族的一员，具有多种调节功能，尤其在肺纤维化中发挥了重要作用[17]。CTGF mRNA在特发性肺纤维化患者的肺泡灌洗液及肺组织中高表达，且可反映肺的纤维化程度[18-19]；此外，还有基础研究证实转化生长因子-β1(TGF-β1)可促使肺成纤维细胞中CTGF表达水平升高，而用小分子RNA干扰CTGF后，可有效抑制肺成纤维细胞的增殖、转化及ECM合成等[20-21]。基于上述研究结果，推测CTGF与UC患者结肠损伤部位的纤维化有关。正常情况下，结肠组织中几乎无CTGF表达，但当机体结肠黏膜损伤时，释放大量炎性因子，同时炎性细胞浸润，机体组织调节TGF-β1/CTGF信号转导通路，进而促使损伤部位纤维化。目前已有多个体内及体外模型表明CTGF是TGF-β1的下游调节因子，可反映组织重塑及纤维化程度[22]。CTGF高表达可刺激间质细胞活化，并诱导其产生更多的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等，进而介导以纤连蛋白为主的ECM沉积，促进间质细胞黏附Ⅰ型胶原，导致肠纤维化发生。有研究表明，CTGF表达与肠黏膜炎性反应程度有关，CTGF与肠上皮细胞损伤、修复及炎性因子释放密切相关[16]。推测CTGF mRNA可能通过调节UC组织中炎性因子水平而控制结肠炎性反应，同时影响肠道菌群，使肠道免疫失衡，促进UC病情进展，进而影响患者预后。

综上所述，CTGF mRNA在UC组织中高表达，且与UC患者病情进展有关。检测UC患者结肠组织中CTGF mRNA的相对表达量有助于评估UC患者的病情及预后。本研究尚存在不足之处：本研究为单中心研究，样本量偏小；在分析影响UC患者预后的相关因素时纳入研究的因素较少。后续将进行多中心研究，扩大样本量，同时收集更多关于UC发病及进展的相关因素，以验证并补充本研究结论。