HS-SPME-GC-MS测定黄花菜不同部位中挥发性成分

刘京宏，陈淼芬，钟晓红，贺 炜，卿志星,3*，曾建国*

1湖南农业大学 园艺园林学院；2湖南农业大学 中兽药湖南省重点实验室；3湖南农业大学 食品科学技术学院，长沙 410128；4绿之韵生物工程集团有限公司，浏阳 410300

黄花菜(HemerocalliscitrinaBaroni；英文名：daylily)，百合科萱草属，别名萱草、忘忧草、金针菜、安神菜、一日黄花等，在我国主要有湖南、陕西、甘肃、山西4个产区，主要品种有30余种[1-3]。黄花菜的花蕾可食用，是我国历史悠久营养丰富的特产蔬菜，其味道鲜美，具有药用价值、食疗价值、经济价值，同时黄花菜花型绚丽、花色鲜艳、香气清新浓郁，被誉为中国的“母亲花”，在食用和观赏方面都具有极大的研究开发价值[4,5]。文献已报道黄花菜中主要有多酚类、二氢呋喃-γ-内酰胺类、蒽醌类、萜类、甾醇类等，这些化合物表现出了强烈的抗菌、抗抑郁、抗癌、杀吸血虫等活性[6-13]。而在黄花菜挥发性成分已报道达70余种[14-18]，但都是对其花苞部位进行挥发性成分研究，未有对其根、茎、叶中的挥发性成分进行分析研究，本实验采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱技术[19]，对湖南省祁东县新型黄花菜早熟品种金娃娃(观食两用品种)进行不同部位(开花、花苞、根、茎、叶)和晒干花苞的挥发性成分测定，为合理开发黄花菜新型早熟品种提供有益的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄花菜材料为早熟品种金娃娃，采自湖南省祁东县黄土镇戈马村，经湖南农业大学曾建国教授鉴定为黄花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)，湖南金萱公司专家曾建新鉴定品种为金娃娃(NO.2019062703)，样品存放湖南农业大学园艺园林学院中兽药湖南省重点实验室-80 ℃冰箱。分别取金娃娃开花、花苞、根、茎、叶和晒干花苞共六部位进行实验。

1.2 仪器与设备

GC/MS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪、GC/MS Solution色谱工作站和NIST.17质谱数据库(日本岛津公司)；固相微萃取仪、Stableflex固相微萃取纤维头(灰色、粉色、蓝色、白色)、顶空萃取瓶(上海安谱实验科技股份有限公司)；CG001型厨房干磨机(深圳市德尔有限公司)；PL203电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；Scientz冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 样品制备

先将金娃娃的开花部位、花苞、根、茎、叶共五部分样品分别用干磨机加液氮磨碎，置于-80 ℃冰箱放置24 h后取出，再放入冷冻干燥机中24 h后制得不同部位干燥样品，然后同磨碎的晒干花苞部位样品分别过100目筛，样品粉末密封保存于避光阴凉处。精密称取开花部位、花苞、根、茎、叶和晒干花苞六部分样品各0.2 g置10 mL顶空萃取瓶，待检测。

1.4 萃取头纤维老化

气化室设定温度240 ℃，需将萃取纤维头插入气相色谱仪气化室中40 min，用以去除纤维头上残存或空气中的杂质。

1.5 萃取方法

初始固相微萃取装置温度为70 ℃，再将装有样品的萃取瓶置于固定在装置中预热，并使用磁力搅拌(400 rpm)，40 min后将萃取进样手柄插入顶空样品瓶中，萃取40 min后，将萃取手柄取出。

1.6 GC-MS条件

CD-WAX色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，上海安谱实验科技股份有限公司)；进样口温度：240 ℃；柱内温度：60 ℃；进样方式：无分流；载气高纯He(含有量99.99%)；载气气体体积流速：0.98 mL/min；分割比例为：-0.1；仪器设置初始温度：60 ℃，维持3 min，再以3 ℃/min升至140 ℃，维持3 min，最后以5 ℃/min升至210 ℃，维持5 min，总共测定时间：50 min。

接口温度：220 ℃；离子源：EI源；离子源温度：200 ℃，电子能量：70 eV；质核比扫描范围：45～500m/z；质谱图采用NIST.17谱库检索比对。

2 结果与分析

2.1 萃取纤维头选择

不同的规格的固相微萃取纤维头会影响测定样品中挥发性成分的种类和丰度。金娃娃晒干花苞样品中挥发性成分种类相对较多，因此实验首先通过四种不同萃取纤维头对金娃娃晒干样品挥发性成分进行测定，筛选出适合的萃取纤维头(见图1)。结果表明：对高含有量挥发性成分种类比较，灰色(60)>粉色(34)>蓝色(31)>白色(26)；对强保留的高沸点挥发性成分比较，蓝色>灰色>白色>粉色。因此选取分离效果佳、吸附种类相对较多、色谱峰响应好的灰色萃取纤维头进行下一步实验。

图1 不同萃取头对金娃娃晒干花苞部位挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compositions of sundried flowers parts from daylily by different color extraction fiber heads注：a.白色萃取头；b.蓝色萃取头；c.粉色萃取头；d.灰色萃取头。Note:a.The white part extraction fiber head;b.The blue part extraction fiber head;c.The pink part extraction fiber head;d.The gray part extraction fiber head.

2.2 柱温条件的选择

最佳柱温一般是选择测量物质的平均沸点或稍微低一些。本实验选用两个柱温(50和60 ℃)对金娃娃晒干样品的挥发性成分进行分析，结果显示在挥发性成分种类和响应丰度上两个柱温(50和60 ℃)并无明显差异，因此本实验设定柱温条件60 ℃。

2.3 取样量的优化

取金娃娃晒干样品以称样递减方式进行取样量的优化，分别取0.5 g样品和0.2 g样品进行置于顶空萃取瓶中进行萃取，结果显示取样量为0.5和0.2 g的挥发性成分种类并无太大差别，且因0.5 g样品过量使3-呋喃甲醇含量占比太高，从而使其他离子峰丰度过低，影响总离子流图峰型整体度的美观，因此选择0.2 g为本实验的取样量。

2.4 黄花菜不同部位挥发性成分解析

通过气相色谱-质谱对金娃娃不同部位(开花、花苞、根、茎、叶)和晒干花苞共6个部位进行测定，得金娃娃不同部位挥发性化学成分的总离子流图(见图2)。经NIST.17质谱数据库检索，采用面积归一法计算各个积分的色谱峰占总峰面积百分比，得金娃娃不同部位中不同组分相对百分比含量及种类(见表1和表2)。

图2 金娃娃不同部位挥发性成分总离子流图Fig.2 Total ion current chromatogram of volatile compositions of different parts from daylily注：a.晒干花苞；b.开花部位；c.花苞部位；d.根部位；e.茎部位；f.叶部位。Note:a.The part of sundried flower;b.The part of flowering;c.The part of flower bud;d.The part of root;e.The part of stem;f.The part of leaf.

表1 金娃娃不同部位挥发性成分种类表

续表1(Continued Tab.1)

种类Volatile type黄花菜(金娃娃)不同部位 Different parts of daylily晒干花苞Dried flower开花Flowering花苞Bud根Root叶Leaf茎Stem醚类 Ether0 0 0200酮类 Ketone8 3 1221烷烃类 Alkane3 4 1311烯烃类 Alkene5 3 2101酚酸类 Phenolic acid9 4 2832其它类 Other10 1 2334总共 Total60 38 24372624

表2 金娃娃不同部位挥发性成分分析表

续表2(Continued Tab.2)

序号No.时间tR(min)化学名称Chemical name分子式Molecular formula相似度Similarity(%)相对百分含量 Relative percentage(%)晒干Sundried开花Flowering花苞Bud根Root叶Leaf茎Stem2611.211壬醛 NonanalC9H18O960.7323.9614.562.4610.4018.212711.6083-辛烯-2-酮 3-Octen-2-oneC8H14O910.57-----2811.977正十四烷 TetradecaneC14H30920.36-----2912.1173-糠醛 3-FuraldehydeC5H4O2981.46--2.788.438.083012.156糠醛 FurfuralC5H4O297-0.97----3112.1735,6,6-三甲基-3-庚烷-2,5-二醇5,6,6-Trimethyl-3-heptyne-2,5-diolC10H18O277--2.73---3212.780乙酸 Acetic acidC2H4O2972.04-----3312.891乙酸铵 Ammonium acetateC2H7NO295---0.310.570.853413.0073-甲硫基丙醛 MethionalC4H8OS89-1.430.62---3513.3121-辛烯-3-醇 1-Octen-3-olC8H16O973.142.880.620.161.031.153614.5033,4,4-三甲基-1-戊炔-3-醇3,4,4,-Trimethyl-1-pentyn-3-olC8H14O87-0.49----3714.582(E,E)-2,4-庚二烯醛 (E,E)-2,4-HeptadienalC7H10O900.34-----3814.7992-乙基己醇 2-Ethyl-1-hexanolC7H8O397-0.621.320.162.782.903915.097左旋樟脑1,7,7-Trimethyl-bicyclo[2.2.1]heptan-2-oneC10H16O90-3.124.651.014.666.344015.125螺己烷-1-羧酸乙酯Spirohexane-1-carboxylic acid,ethyl esterC9H14O2800.39-----4115.332苯甲醛 BenzaldehydeC7H6O950.173.55--1.19-4215.6053,5-辛二烯-2-酮 3,5-Octadien-2-oneC8H12O943.02-----4316.089丙酸 Propanoic acidC3H6O2950.12-----4416.346(Z)-2-壬烯醛 (Z)-2-NonenalC9H16O94-2.90----4516.6153-呋喃甲基乙酸酯 3-Furylmethyl acetateC7H8O3901.74--0.390.100.304617.014芳樟醇 LinaloolC10H18O9714.301.311.430.392.132.024717.210乙酸芳樟酯 Linalyl acetateC12H20O2950.63--0.11--4817.334正辛醇 1-OctanolC8H18O950.062.390.310.080.740.864917.4403,5-辛二烯-2-酮 3,5-Octadien-2-oneC8H12O911.17-----5017.7942,3-丁二醇 2,3-ButanediolC4H10O294-4.30----5117.774(1,7,7-三甲基降冰片烷-2-YL)乙酸(1R,4S)-1,7,7-Trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-yl acetateC12H20O294---0.190.152.865217.804乙酸异龙脑酯 Isobornyl acetateC12H20O291--1.15---5317.9912,2,5,5-四甲基-3-己烯2,2,5,5-Tetramethyl-hex-3c-eneC10H20810.15-----5418.042反-2-,顺-6-壬二烯醛 (E,Z)-2,6-NonadienalC9H14O94-0.41----5518.6774-萜烯醇 4-Terpinen-olC10H18O870.13-----5619.014丙酸糠酯 2-Furanmethanol,propanoateC8H10O3800.47-----5719.133Beta-环柠檬醛 beta-CyclocitralC10H16O91----0.58-5819.396反式-2-辛烯-1-醇 (E)-2-Octen-1-olC8H16O951.980.44----5919.654苯乙醛 BenzeneacetaldehydeC8H8O98-14.8616.16--31.496019.931藏红花醛2,6,6-Trimethyl-1,3-cyclohexadiene-1-carboxaldehydeC10H14O940.67-----6120.659糠醇 2-FuranmethanolC5H6O2930.09-----

续表2(Continued Tab.2)

序号No.时间tR(min)化学名称Chemical name分子式Molecular formula相似度Similarity(%)相对百分含量 Relative percentage(%)晒干Sundried开花Flowering花苞Bud根Root叶Leaf茎Stem6221.0392-甲基丁酸 2-Methyl-butanoic acidC6H12O288---0.44--6321.0983-甲基戊酸 3-Methyl-pentanoic acid,C5H10O2921.040.36----6421.4923-呋喃甲醇 3-FuranmethanolC5H6O29827.669.9427.5353.8417.170.316522.208(+)-α-松油醇 (+)-alpha-TerpineolC10H18O951.770.22----6623.168邻苯二甲醚 1,2-DimethoxybenzeneC8H10O289---0.17--6723.464正戊酸 Pentanoic acidC5H10O2930.79-----6823.7584-氧代-2-己烯醛 4-Oxohex-2-enalC6H8O2940.43-----6924.288(R)-α-(羟甲基)苯乙酸甲酯(R)-α-(Hydroxymethyl)benzeneacetic acid methyl esterC10H12O382-0.16----7024.3102-苯基丙醇 2-PhenylisopropanolC9H12O86-----0.897124.458水杨酸甲酯 Methyl salicylateC8H8O392-0.28----7224.543乙酸香叶酯 Geranyl acetateC12H20O2930.19--0.11--7324.808惕格酸 Tiglic acidC5H8O293---0.25--7425.678二乙二醇丁醚 2-(2-Butoxyethoxy)ethanolC8H18O396---0.19--7526.0932-乙基环己酮 2-EthylcyclohexanoneC8H14O960.69-----7627.288正己酸 Hexanoic acidC6H12O2996.871.091.005.801.020.687727.695香叶醇 2,7-Dimethylocta-2,6-dieneC10H18O950.12-----7827.8886,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮6,10-Dimethyl-5,9-undecadien-2-oneC13H22O83---0.14--7928.092苯甲醇 Benzyl alcoholC7H8O85-0.85----8028.111香叶基丙酮 GeranylacetoneC13H22O88----0.62-8128.7971,1'-二羟基双环己基1,1'-Diol-bicylcohexylC12H22O2820.28-----8228.806己酸糠酯 Furfuryl hexanoateC11H16O382---0.67--8329.251苯乙醇 Phenylethyl alcoholC8H10O980.681.51-0.32--8429.483苯乙腈 Benzyl nitrileC8H7N940.159.690.94---8529.7662,6-二叔丁基对甲酚 Butylated hydroxytolueneC15H24O92---0.05-0.378630.399β-紫罗兰酮 β-IononeC13H20O880.11-----8731.058庚酸 Heptanoic acidC7H14O2930.70-----8831.0585-己烯酸 5-Hexenoic acidC6H10O287---1.47--8931.226反式-3-己烯酸 (E)-3-Hexenoic acidC6H10O284-0.36--0.83-9031.3262-己基噻吩 2-Hexyl-thiopheneC10H16S810.27-----9131.7293-甲基-1-戊醛 3-Methyl-pentanaC6H12O850.10-----9232.753癸二腈 1,10-DicyanodecaneC12H20N2821.75-----9333.1233-甲基吡唑 3-Methyl-1h-pyrazoleC4H6N2860.22-----9433.542DL-泛酰内酯2(3H)-Furanone,dihydro-3-hydroxy-4,4-dimethyl-C6H10O3960.30-----9533.7153-庚烯酸 3-Heptenoic acidC7H12O289--0.13---9635.077反式-橙花叔醇 NerolidolC15H26O880.08-----9735.6892-庚烯酸 2-Heptenoic acidC7H12O2960.50-----9836.5071-(苯基)-2-硝基乙烷 (2-Nitroethyl)-benzeneC8H9NO295-0.59----9936.676柏木脑 CedrolC15H26O930.40-----

续表2(Continued Tab.2_

序号No.时间tR(min)化学名称Chemical name分子式Molecular formula相似度Similarity(%)相对百分含量 Relative percentage(%)晒干Sundried开花Flowering花苞Bud根Root叶Leaf茎Stem10037.2999-氧杂双环[6.1.0]壬-2-烯9-Oxabicyclo[6.1.0]non-2-eneC9H12O87---0.92--10137.3477a-羟基八氢-1H-1-茚酮7a-Hydroxyoctahydro-1H-inden-1-oneC9H14O2860.10-----10237.6644,7-二甲基-2,4,8-三烯-癸烷4,7-Dimethyl -2,4,8-triene-decanC10H2083---0.41--10337.938植酮 PhytoneC18H36O860.19-----10438.170螺[环丙烷1,6'-[3]氧三环[3.2.1.0(2,4)]辛烷Spiro[cyclopropane-1,6'-[3]oxatricyclo[3.2.1.0(2,4)]octane]C9H12O83-0.47-22.991.05-10538.508壬酸 Nonanoic acidC9H18O2940.140.18----10638.9593-糠酸 3-Furancarboxylic acidC5H4O3972.52-----10740.4753-乙基-4-甲基吡咯-2,5-二酮3-Ethyl-4-methyl-1h-pyrrole-2,5-dioneC7H9NO2950.34-----10841.817二氢猕猴桃内酯2,6,6-Trimethyl-2-hydroxycyclohexylidene)acetic acid lactoneC11H16O2960.58-----10941.9412,4-二叔丁基苯酚 2,4-Di-tert-butylphenolC14H22O83---0.080.093.7011042.364(2E)-3,7-二甲基辛基-2,6-二壬酸(2E)-3,7-Dimethylocta-2,6-dienoic acidC10H16O282---0.06--

3 讨论

实验采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用技术，对金娃娃的不同部位(开花、花苞、根、茎、叶)和晒干花苞的干燥样品进行挥发性成分测定(见图3)，共鉴定出110种不同化合物，其中晒干花苞部位共鉴定60种，部位特有化合物37种；开花部位鉴定38种，其部位特有化合物12种；花苞部位鉴定24种，其部位特有化合物3种；根部位鉴定37种，部位特有化合物14种；叶部位鉴定26种，其部位特有化合物5种；茎部位鉴定24种，其部位特有化合物2种。根部位中挥发性成分与花部位(晒干花部位、开花部位和花苞部位)中的挥发性成分差异性较大，所有部位中含量最高的化合物虽都为3-呋喃甲醇(3-furanmethanol)，但螺[环丙烷1，6'-[3]氧三环[32.1.0(2，4)]辛烷在根部位含量其次。

图3 金娃娃不同部位挥发性成分总离子流图Fig.3 Total ion current chromatogram of chemical composition of different parts of volatile from daylily注：a.根部位；b.茎部位；c.叶部位；d.开花部位；e.花苞部位；f.晒干花苞。Note:a.The part of root;b.The part of stem;c.The part of leaf;d.The part of flowering;e.The part of flower bud;f.The part of sundried flower.

各部位中存在7种相同的挥发性成分，包括有正己醛(hexanal)、壬醛(nonanal)、1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)、芳樟醇(linalool)、正辛醇(1-octanol)、3-呋喃甲醇(3-furanmethanol)、正己酸(hexanoic acid)。采用相对峰面积法进行相对含量比较分析(见图4)，结果表明：正己醛、正辛醇在七个部位中含量均较低，其中开花部位含量最高。壬醛含量在各部位中含量较高，是主要的黄花菜挥发性成分，其中开花部位含量最高。而1-辛烯-3-醇含量在各部位中含量均较低，晒干样品含量最高。芳樟醇含量在晒干花苞样品最高，叶部位其次。3-呋喃甲醇在各部位含量均较高，是黄花菜最主要的挥发性物质，其中根部位含量最高，其次是晒干花苞样品。正己酸含量在各部位含量中较高，其中晒干花苞样品含量最高，其次是根部位。

图4 金娃娃不同部位相同挥发性成分含量对比图Fig.4 Comparison chart of the same volatile components in different parts from daylily

芳樟醇具有柔和、轻扬的果香气息，是香水香料、日化产品及其他芳香剂使用频率最高的香料品种，同时还具有抗病毒、除臭、杀虫、镇静等作用[20]，文献还未曾有过报道黄花菜挥发性成分中富含芳樟醇，但早熟黄花菜品种金娃娃不同部位和晒干花苞的干燥样品中均含有芳樟醇，且晒干后含量明显升高，这为早熟黄花菜品种(金娃娃)挥发性成分的开发提供理论依据。

黄花菜样品在所有花部位(晒干花苞、花苞、开花)对比中(见图5)，挥发性成分含量为：晒干部位>开花部位>花苞部位。晒干部位与开花部位、花苞部位共有9种相同化合物，分别为(E)-Β-罗勒烯、甲基庚烯酮、壬醛、1-辛烯-3-醇、正辛醇、3-呋喃甲醇、正己酸、苯乙腈和芳樟醇，它们是黄花菜花中主要香气成分。在晒干部位与开花部位共有15种相同化合物，晒干部位与花苞部位共有11种相同化合物，开花部位与花苞部位共有13种相同化合物。黄花菜样品在晒干后能闻到浓郁的清香味，表明晒干花部位的挥发性成分比冷冻干燥后花苞样品的挥发性成分鉴定的多一些，可能原因是在温度作用下，蛋白质、碳水化合物和类脂能够分解形成非常复杂的香气系统，醇类物质、酮类物质和酚酸类物质相对含量升高[21]。

图5 金娃娃晒干花部位与开花、花苞 部位挥发性成分差异对比图Fig.5 Comparison diagram of the volatile components of the positions of dried flower,flowering and flower bud of daylily注：a.晒干部位：60种；b.开花部位：38种；c.花苞部位：24种；d.晒干部位与开花部位相同：15种；e.开花部位与花苞部位相同：13种；f.晒干部位与花苞部位相同：11种；g.晒干部位与开花部位、花苞部位相同：9种。Note:a.Dried flower:60 kinds;b.Flowering:38 kinds;c.Flower bud:24 kinds;d.The same number of dried flower and flowering:15 kinds;e.The same number of flowering and flower bud:13 kinds;f.The same number of dried flower and flowering:11 kinds;g.The same number of dried flower,flowering and flower bud:9 kinds.

4 结论

黄花菜不仅是我国重要的特产蔬菜，同时因花型饱满、色泽艳丽也是珍贵的园艺佳品。食用黄花菜一般采收时期为7～8月，而早熟品种金娃娃在4月就能开始采收，这不仅能减缓因采收时间集中而导致的采收与加工压力，作为附加还可延伸花期支撑黄花菜特色旅游产业。本实验对黄花菜早熟品种金娃娃的不同部位(开花、花苞、根、茎、叶)和晒干花苞的干燥样品进行挥发性成分测定，共鉴定出110种不同挥发性化合物，金娃娃晒干部位挥发性成分主要以醇类和醛类和酮类为主，具有辛辣且浓郁的香味，开花部位和花苞部位主要以醇类和醛类为主，具微辛辣且清新的香味，根部位主要以酚酸类、醇类、醛类为主，赋予了独特土腥味，而茎和叶挥发性成分较少，主要以醇类、醛类为主，具有淡雅的香味。该结论为后续黄花菜新型早熟品种(金娃娃)中挥发性成分的开发与加工利用提供了一定的理论指导。