响应面法优化Chlorella vulgaris 224胞外多糖积累及其抑菌和抗氧化活性

孙建瑞，赵君峰，符丹丹，原江锋，王大红

河南科技大学食品与生物工程学院 洛阳市微生物发酵工程技术研究中心，洛阳 471023

微藻因具有光合效率高、生产周期短、油脂含量高、不受季节和气候限制等优点[1]，已成为生产生物柴油最有潜力的原料之一，以微藻制备生物柴油已经成为当前的研究热点[2]。但是微藻生产油脂存在规模化培养、采收及油脂提取方面成本较高的问题，这限制了微藻生产生物柴油的商业化应用。微藻除了可以用来生产生物柴油，还可以生产许多高附加值代谢产物，如活性多糖[3]、叶黄素[4]、多不饱和脂肪酸[5]、虾青素[6]、胡萝卜素[7]、凝集素[8]、藻胆蛋白[9]等各种活性物质，这些活性物质被广泛应用于食品添加剂、营养保健品及医药品等领域，具有很高的经济价值[10]。因此，从降低微藻生产生物柴油成本方面考虑，可以将这些高附加值代谢产物和油脂一起开发利用。

微藻可以产生多种胞内或胞外多糖物质，这些多糖具有调节机体的免疫力和抗肿瘤、抗炎症、抗病毒、抗菌活性、抗氧化活性等[11]。Guzman等[12]发现绿藻多糖具有一定的免疫抑制剂活性和抗炎活性。Chen等[13]研究发现从海水小球藻和紫球藻中提取的多糖具有一定的抑制细菌和真菌的活性，尤其对中华根霉与稻瘟病菌的抗菌活性极强。Tannin-Spitz等[14]研究发现提取的紫球藻多糖，及其降解后的不同多糖组分具有清除自由基的能力。Sun等[15]发现球等鞭金藻的胞外多糖具有抑制大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的活性。Chen等[16]研究发现蔷薇藻的胞外粗多糖具有清除超氧阴离子以及抑制亚油酸自动氧化的能力。同时，国外学者对藻类多糖在医药保健和食品领域的应用也有深入研究[17]。

然而，微藻多糖的研究大多集中在胞内多糖，对胞外多糖的研究较少。实验室前期筛选到淡水微藻(编号为224号)，其油脂含量可以达到23.8%，初步鉴定为小球藻(C.vulgaris)，有一定的潜在应用前景。本课题组初步实验发现其能够积累胞外多糖，且有一定的抑菌和抗氧化活性，因此在培养末期收集藻体提取油脂的同时回收培养液，分离其中的胞外多糖，可以增加C.vulgaris的综合利用价值。本研究以C.vulgaris作为研究对象，采用响应面法优化其胞外多糖的积累，并对其抑菌活性和抗氧化活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

224号藻株小球藻(C.vulgaris)由实验室前期筛选得到，受试菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、中华根霉(Rhizopuschinensis)和黑曲霉(Aspergillusniger)来自河南科技大学食品与生物工程学院。

实验用三氯乙酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、二丁基羟基甲苯(BHT)、浓硫酸、碳酸氢钠、苯酚、乙醇等无机试剂、有机溶剂均为国产分析纯；透析袋(截留分子量为7.0 kDa)。

1.2 仪器与设备

万分之一天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；TU-1800型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；Eppendorf 5417R型台式高速冷冻离心机(德国艾本德股份公司)。

1.3 方法

1.3.1 微藻的培养

以对数生长期的藻液作为种子液，接种于2 L三角瓶中(内装1 L SE培养基，初始pH 7.0)，接种量为10%(V/V)，然后在温度25 ℃的恒温光照培养室中培养，光暗比16 h∶8 h，光强度约为100 μmol/m2/s，培养14天。

1.3.2 胞外多糖的制备

微藻培养液6 000 rpm，离心20 min，分别收集藻体和上清液；上清液60 ℃旋转蒸发浓缩后透析96 h；收集透析液，加入3倍体积的无水乙醇，然后静置过夜；8 000 rpm离心15 min取沉淀；用5 mL蒸馏水将沉淀溶解，加入适量TCA，搅拌均匀至沉淀不再溶解；8 000 rpm离心10 min，收集上清液；再次添加3倍体积的无水乙醇于上清液中，沉淀3 h；8 000 rpm离心10 min取沉淀，所得沉淀即为胞外多糖；冷冻干燥后放4 ℃备用。

1.3.3 胞外多糖含量和产量的测定

采用苯酚-硫酸法[18]检测胞外多糖的浓度，胞外多糖浓度的计算采用线性方程：Y= 11.895X-0.044 1，R2= 0.996 8(以葡萄糖作为标准品配制标准溶液，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线，得到糖浓度与吸光值的关系)，然后分别根据公式(1)和(2)计算胞外多糖含量和产量。

胞外多糖含量(%)=

(1)

胞外多糖产量(mg/L)=

(2)

1.3.4 单因素试验

分别考察微藻培养基中NaCl(30、60、90、120、150 mg/L)、NaNO3(100、200、300、400、500 mg/L)、MgSO4(30、60、90、120、150 mg/L)、K2HPO4(50、100、150、200、250 mg/L)和NaHCO3(0、1.0、2.0、3.0、4.0 g)对C.vulgaris224胞外多糖积累量的影响。

1.3.5 响应面试验设计

单因素试验之后，进一步进行Plackett-Burman实验以筛选出多个考察因素中的重要因素，最终选择NaNO3、NaCl和NaHCO3三个因素进行响应面试验，各个因素的水平设计如表1所示。

表1 响应面试验各个因素及水平

1.3.6 抑菌实验

将受试菌分别接种在对应的细菌和真菌培养基上，置于恒温培养箱中进行培养(真菌28 ℃ 2天，细菌37 ℃ 1天)，然后用接种环挑取活化后的菌种一环于灭菌的蒸馏水中，混合均匀后制成菌悬液。

抑菌试验采用滤纸片法[19]：将灭菌过的直径6 mm的圆形滤纸片烘干后，浸泡于制备好的多糖溶液中12 h；然后将制备好的各种菌悬液(200 μL)置于相应的固体培养基表面，涂布均匀；用灭过菌的镊子将浸泡好的滤纸片贴在培养基表面，之后将培养皿放在恒温培养箱中进行培养(细菌37 ℃ 18～24 h，真菌28 ℃ 48～72 h)，观察和测量抑菌圈直径；无菌水作为空白对照。

1.3.7 DPPH自由基清除能力测定

参照Feng等[20]的方法测定，取1.0 mL质量浓度不同的多糖溶液，加入0.004% DPPH溶液4 mL，充分混匀，黑暗下静置30 min，以无水乙醇作空白对照，相应浓度的BHT作阳性对照，于517 nm处测定其吸光值。每一样品平行测3 次，取其平均值。清除率公式可表示为：

式中：A1为样品或者阳性对照的吸光值；A2为空白对照的吸光值。

1.3.8 羟基自由基清除能力测定

参照Feng等[20]的方法测定，在试管中分别加入0.4 mL pH 7.4的PBS、0.25 mL重蒸水、0.15 mL 5 mmol/L的邻二氮菲溶液和0.5 mL 7.5 mmol/L的FeSO4后混合均匀。然后加入1.0 mL不同质量浓度的多糖样品溶液，最后加入1%的过氧化氢溶液0.1 mL，37 ℃水浴保温60 min，536 nm处测定吸光值。阳性对照采用对应浓度的BHT，损伤管中不加样品，对照管中样品和过氧化氢都不加，空白管中不加过氧化氢。每一样品平行测3 次，取其平均值。清除率公式可表示为：

式中A样品、A损伤、A对照、A空白分别为536 nm处样品管、损伤管、对照管和空白管的吸光值。

1.3.9 总还原力测定

参照Chen[21]的方法测定，在试管中加入1.0 mL质量浓度不同的多糖溶液，然后加入0.2 mol/L、pH 6.6的PBS 2.5 mL，1%铁氰化钾2.5 mL，置于50 ℃水浴中20 min；加入2.5 mL 10%的TCA，混合均匀后3 000 rpm离心10 min；吸取2.5 mL上清液，加2.5 mL重蒸水和 0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，以相应浓度的BHT作阳性对照，在700 nm处测定吸光值。每一样品平行测3 次，取其平均值。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 NaCl对胞外多糖积累的影响

如图1所示，当NaCl浓度为90 mg/L时，C.vulgaris224胞外多糖产量达到最高的21.59 mg/L；之后随着NaCl浓度的增加，胞外多糖产量呈下降趋势，而胞外多糖的含量却继续升高，各浓度之间的差异达到显著水平(P<0.05)。这可能是因为C.vulgaris在盐胁迫下会分泌较多的胞外多糖来抵御外界环境的变化；但是较高的盐浓度会抑制C.vulgaris的生长，导致其生物量锐减，从而造成胞外多糖产量的下降。因此，NaCl浓度选择90 mg/L进行后续实验。

图1 NaCl对胞外多糖积累的影响Fig.1 Effect of NaCl on extracellular polysaccharide accumulation

2.1.2 NaNO3对胞外多糖积累的影响

图2 NaNO3对胞外多糖积累的影响Fig.2 Effect of NaNO3 on extracellular polysaccharide accumulation

2.1.3 MgSO4对胞外多糖积累的影响

当MgSO4浓度从30 mg/L升高到90 mg/L时，C.vulgaris胞外多糖的含量和产量呈上升趋势；在90 mg/L时分别达到最大的11.98%和25.75mg/L；之后随着MgSO4浓度的增加，胞外多糖的含量和产量则逐渐降低(图3)，各浓度之间的差异达到显著水平(P<0.05)。研究表明，Mg2+有利于藻类的生长发育，它能够参与藻细胞内糖、脂肪和蛋白质等物质的代谢；还可以作为酶的活化剂促进藻细胞的新陈代谢。因此，选择MgSO4浓度为90 mg/L进行后续实验。

图3 MgSO4对胞外多糖积累的影响Fig.3 Effect of MgSO4 on extracellular polysaccharide accumulation

2.1.4 K2HPO4对胞外多糖积累的影响

当K2HPO4浓度为100 mg/L时，C.vulgaris胞外多糖的产量和含量都达到最高，分别为12.03%和25.59 mg/L；之后随着K2HPO4浓度的升高，它们都呈下降趋势(图4)，各浓度之间的差异达到显著水平(P<0.05)。因此，K2HPO4浓度选择100 mg/L进行后续实验。

图4 K2HPO4对胞外多糖积累的影响Fig.4 Effect of K2HPO4 on extracellular polysaccharide accumulation

图5 NaHCO3对胞外多糖积累的影响Fig.5 Effect of NaHCO3 on extracellular polysaccharide accumulation

2.1.5 NaHCO3对胞外多糖积累的影响

添加NaHCO3后，C.vulgaris胞外多糖的含量和产量有明显的增加，当NaHCO3浓度为2.0 g/L时胞外多糖的含量和产量达到最大，分别为15.77%和43.45 mg/L；之后进一步增加NaHCO3的浓度，胞外多糖的含量和产量则呈大幅下降(图5)，各浓度之间的差异达到显著水平(P<0.05)。

NaHCO3能够为微藻的生长发育提供了光合作用所需的碳源，适量添加NaHCO3能够促进微藻的生长繁殖。NaHCO3的添加虽然可以促进C.vulgaris224的生长发育，但微藻培养基的pH会因NaHCO3的加入而改变，从而使微藻培养基呈碱性，不利于C.vulgaris胞外多糖的积累。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果

根据单因素试验结果，结合PB实验，最终选择NaNO3、NaCl和NaHCO3作为自变量，响应值选择微藻的胞外多糖产量，进行响应面优化试验，设计方案及结果见表2。

表2 响应面设计方案及结果

2.2.2 模型及显著性分析

实验结果采用Design-Expert软件进行分析，得到的拟合方程如下：

Y=69.92-0.50X1-2.18X2+3.07X3+0.38X1X2+2.44X1X3-4.11X2X3-5.21X12-6.94X22-4.28X32

同时，利用分析软件对回归方程的方差分析结果见表3。

由表3可以看出，该模型是高度显著的(P<0.01)。同时，模型中X2、X3、X1X3、X2X3、X12、X22、X32的P值均小于0.05，说明它们都是显著的，即它们对微藻胞外多糖的积累均有显著影响。该模型的失拟项不显著(P﹥0.05)，说明模型选择合适。

另外，该模型相关系数R2为0.958 4，能够解释95.84%的实验结果，说明该模型相关度很好；模型的变异系数为4.55%，说明实验操作可靠，该模型能够很好的反映实验结果。总之，该模型拟合度好，实验误差小，能够用来分析和预测C.vulgaris胞外多糖的产量。

表3 方差分析表

注：*差异显著，P<0.05；**差异极显著，P<0.01。

Note：*Significant,P<0.05；**Very significant,P<0.01.

各个因素对C.vulgaris胞外多糖产量影响程度的大小顺序依次为:NaHCO3>NaCl>NaNO3，其中NaHCO3对胞外多糖产量的影响极显著，NaCl对胞外多糖产量的影响显著。

2.2.3 响应曲面分析

响应曲面图可以形象地看出各因素之间的相互作用及最佳参数，等高线的形状可以看出两个因素之间交互作用的强弱[22]。图6显示的是各个因素交互作用的响应曲面图和等高线形状图。

当NaHCO3浓度为2.0 g/L时，微藻胞外多糖产量随着NaCl和NaNO3浓度的升高先增加后降低；等高线偏圆形，表明NaCl和NaNO3两个因素之间的交互作用相对较弱(图6a)。

当NaCl浓度为90 mg/L时，微藻胞外多糖产量随着NaHCO3和NaNO3浓度的升高先增加后降低；等高线偏椭圆形，说明NaHCO3和NaNO3两个因素之间的交互作用显著(图6b)。

当NaNO3浓度为200 mg/L时，微藻胞外多糖产量随着NaHCO3和NaCl浓度的升高先增加后降低。等高线呈椭圆形，表明NaHCO3和NaCl两个因素之间的交互作用显著(图6c)。

通过软件的进一步分析可以得到最大响应值(Y)时各因素(X1、X2、X3)对应的值分别为：X1=203.13 mg/L，X2=85.34 mg/L，X3=2.13 g/L。在此条件下，理论上C.vulgaris224胞外多糖的产量为71.051 3 mg/L。

2.2.4 验证实验

根据响应面确定的各因素的最优浓度配制微藻培养基，来验证所得结果的可靠性。在实验条件下，C.vulgaris224胞外多糖产量为70.365 7 mg/L，与理论值很接近，相对误差仅为0.96%，说明该回归模型准确度高。经优化后，C.vulgaris224胞外多糖比优化前提高了1.62倍。

2.3 胞外多糖的抑菌活性

C.vulgaris224胞外多糖抑菌实验结果如表4所示，胞外多糖对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌作用，抑菌圈直径可以达到14.72 mm；同时对白色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌有较弱的抑菌作用，抑菌圈较小；对枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、黑曲霉和中华根霉没有抑菌作用。

综上所述，C.vulgaris224的胞外多糖对细菌具有抑菌作用，对真菌没有抑菌作用；胞外多糖对革兰氏阳性菌的抑制作用要强于革兰氏阴性菌。

图6 各因素交互作用对胞外多糖产量影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots of effects of interaction between various factors on the production of extracellular polysaccharide

表4 C.vulgaris 224胞外多糖抑菌实验结果

2.4 胞外多糖的抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

图7 胞外多糖对DPPH自由基的清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging activities of extracellular polysaccharide from C.vulgaris 224

C.vulgaris224的胞外多糖对DPPH自由基的清除能力随着样品浓度的升高而增强(图7)。在检测的浓度范围内，胞外多糖的抗氧化活性略低于阳性对照BHT。结果说明，C.vulgaris224的胞外多糖具有较强的清除DPPH自由基的能力。

2.4.2 羟基自由基清除能力

C.vulgaris224的胞外多糖对羟基自由基的清除能力随着样品溶液质量浓度的增加而增强；在30 mg/mL时，胞外多糖对羟基自由基的清除率已超过50%(图8)。在检测的质量浓度范围内，胞外多糖的抗氧化活性略低于阳性对照BHT。结果说明，C.vulgaris224的胞外多糖具有较强的清除羟基自由基的能力。

图8 胞外多糖对羟基自由基的清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activities of extracellular polysaccharide from C.vulgaris 224

2.4.3 总还原能力

C.vulgaris224胞外多糖的总还原能力随着样品浓度的升高而逐渐增强(图9)。在检测的浓度范围内，胞外多糖的总还原力始终略低于阳性对照BHT的总还原力。结果说明，胞外多糖的总还原力较强。

图9 胞外多糖的总还原能力Fig.9 Reducing power of extracellular polysaccharide from C.vulgaris 224

3 结论

本研究以油脂含量较高的淡水微藻C.vulgaris224作为研究对象，采用响应面法优化其胞外多糖的积累，并对其抑菌活性和抗氧化活性进行研究。通过响应面优化得到的C.vulgaris224积累胞外多糖的最佳参数为NaNO3203.13 mg/L、NaCl 85.34 mg/L、NaHCO32.13 g/L，在此条件下，C.vulgaris224胞外多糖产量为70.365 7 mg/L，比优化前提高了1.62倍。抑菌实验结果表明C.vulgaris224的胞外多糖对细菌有一定程度的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌作用，对白色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌的抑菌作用较弱；对真菌没有抑菌作用。同时，抗氧化实验结果表明C.vulgaris224的胞外多糖具有较强的抗氧化活性。本研究为筛选天然抗菌、抗氧化活性物质提供了一定的参考价值，同时为产油微藻的综合开发、扩大其应用领域提供了一定的理论依据。