软枣猕猴桃多糖的提取及对酵母菌防紫外线的研究

李昕昕，梁佳文，聂 妍，陈晓玉，韩晓凤，韩春然

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076）

0 引言

随着科技的进步和社会的发展，手机、电脑的普及使人们在日常生活中受到辐射的几率大大提高，对人体有诸多不利影响，为了减少辐射对健康的影响，各种防辐射食品应运而生，从1997年至今，国家食品药品监督管理局公布的防辐射产品有175种，多糖为有效成分的产品数量最多，多糖是一类以单糖分子为基本结构的高分子聚合物，是生物体的结构物质和贮能物质，能够参与人体多种重要生命活动。研究表明，多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗突变、抗衰老等多种药理作用[1]，但这些保健品中的多糖主要来源于灵芝、当归等药用植物，来源于食物的多糖很少。软枣猕猴桃（Actinidia arguta），别名软枣子，属猕猴桃科、猕猴桃属落叶藤本植物，主要分布在我国的东北、华北、华中、西北、西南，以及俄罗斯的远东地区、朝鲜半岛、日本等国家和地区，以我国东北地区的资源最为丰富。软枣弥猴桃酸甜可口，富含维生素和氨基酸[2]，软枣猕猴桃中多糖含量也较丰富[1]，以热水浸提法提取软枣猕猴桃中的多糖，并研究其抗紫外辐射能力，以期为软枣猕猴桃防辐射保健食品的开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

软枣猕猴桃，市售；无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司提供；苯酚，天津市大茂化学试剂厂提供；硫酸，天津市耀华化学试剂有限责任公司提供；葡萄糖标准样品，天津市致远化学试剂有限公司提供；盐酸，西陇化工股份有限公司提供；氢氧化钠，天津市大陆化学试剂厂提供；蛋白胨，日本制造株式会社提供；酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司提供。

1.2 仪器与设备

722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；DGH 9145A型电热鼓风干燥箱、HWS24型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司产品；DT5-1型低速自动平衡离心机，北京时代北利离心机有限公司产品；PB-10型酸度计，赛多利思科学仪器产品；SYQ-DSX-280A手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；SW-CJ-2D型双人单面净化工作台型，苏州净化产品。

1.3 试验方法

1.3.1 软枣猕猴桃多糖的提取

软枣猕猴桃多糖提取工艺流程：

参考李林等人[3]的方法，略有修改。取1 g软枣猕猴桃冻干粉、45 mL蒸馏水→混合→90℃下水浴3 h→以转速3 500 r/min离心10 min→取上清液浓缩至原体积的1/4→冷却→加入浓缩后软枣猕猴桃粗多糖溶液体积的4倍99.8%乙醇溶液→搅拌使其充分反应→以转速3 500 r/min离心10 min→取离心后的沉淀→加热挥发乙醇→加入10 mL蒸馏水充分溶解→粗多糖溶液。

1.3.2 软枣猕猴桃粗多糖提取工艺的单因素试验

软枣猕猴桃多糖提取基础条件为料液比1∶25，提取时间3 h，pH值7，软枣猕猴桃粉的目数90目，分别研究提取温度50，60，70，80，90，100℃；料液比 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；提取时间 1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h；提取 pH 值6，7，8，9，10对软枣猕猴桃多糖提取率的影响，每个水平重复3次，取其平均值。

1.3.3 软枣猕猴桃多糖提取正交试验

（1） 正交试验。以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C） 和提取溶液pH值（D） 为考查因素，以粗多糖提取率为指标，按照L9（34）进行正交试验，确定软枣猕猴桃多糖最佳的提取工艺。

软枣猕猴桃粗多糖提取正交试验因素与水平设计见表1。

表1 软枣猕猴桃粗多糖提取正交试验因素与水平设计

（2）验证试验。在获得的最佳条件下提取软枣猕猴桃多糖，平行3次使用最佳工艺参数的试验，取其平均值。

1.3.4 软枣猕猴桃多糖抗辐射能力的研究

（1）培养基的制作。①酵母菌基础培养基的制作，酵母浸出葡萄糖培养基（YPD） 的配制：配制500 mL培养溶液，称取1%的蛋白胨5 g，0.5%的酵母膏2.5 g，充分溶解。于121℃下灭菌30 min[4]。②多糖培养基的制作，将获得的软枣猕猴桃粗多糖配成质量浓度为0.257 g/mL的溶液，与酵母培养基混合，分别配置成粗多糖含量为5%，10%，15%，20%，25%的培养基，于121℃下灭菌30 min。冷却后备用。

（2） 粗多糖浓度对酵母菌抗紫外照射的影响。培养皿中分别倒入软枣猕猴桃多糖含量为5%，10%，15%，20%，25%的培养基，接入2%的酵母菌，固定紫外辐射距离75 cm，紫外辐射时间180 s，于28℃下培养24 h，用血球计数板计算酵母菌的数量，显微镜观察酵母菌形态。每个水平重复3次，取平均值。

1.3.5 测定方法

（1）多糖含量的测定。①葡萄糖标准曲线的绘制，精确称取10 mg经105℃干燥至恒质量的分析纯葡萄糖，定容到100 mL的定容瓶内，再分别配置质量浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL的葡萄糖标准溶液[2]，分别取0.5 mL以上溶液，再分别加入5%苯酚1 mL，浓硫酸5 mL，于波长490 nm处测定不同质量浓度溶液的吸光度A。以标液的质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖溶液的标准曲线图[5]。②软枣猕猴桃多糖提取率的测定，准确吸取5.0 mL软枣猕猴桃粗多糖提取液，稀释后定容于50 mL容量瓶中，充分摇匀，作为样液。再吸取0.2 mL样液于试管中，分别加入1.0 mL苯酚溶液、5.0 mL浓硫酸，充分摇匀放置，用1.0 mL蒸馏水作空白对照。于波长490 nm处测吸光度，平行3次。根据所得葡萄糖标准曲线，计算软枣猕猴桃粗多糖含量[5-6]。

软枣猕猴桃粗多糖提取率计算公式：

式中：C——由标准曲线得到的软枣猕猴桃粗多糖的质量浓度，mg/mL；

V——定容后的总体积，mL；

n——样液稀释倍数；

m——软枣猕猴桃粗多糖粉末质量，g。

（2）酵母菌计数。采用血球计数板计算酵母菌数量[7]。

2 结果与分析

2.1 软枣猕猴桃粗多糖的提取

2.1.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

由图1可知，回归方程为Y=7.94X-0.031，线性相关系数R2=0.672。

2.1.2 单因素试验

（1）提取温度对软枣猕猴桃多糖提取率的影响。提取温度对软枣猕猴桃多糖提取率的影响见图2。

图2 提取温度对软枣猕猴桃多糖提取率的影响

由图2可知，当提取温度为60～90℃时，随着提取温度不断升高，软枣猕猴桃多糖的提取率也在不断升高；当温度升高至100℃时，多糖的提取率逐渐趋于平缓，甚至稍有下降。因此，当提取温度为90℃时较为适宜。

（2）提取时间对软枣猕猴桃多糖提取率的影响。

提取时间对软枣猕猴桃多糖提取率的影响见图3。

图3 提取时间对软枣猕猴桃多糖提取率的影响

随着提取时间的增加，软枣猕猴桃多糖的提取率呈明显的上升趋势；当提取时间超过3 h，多糖提取率增加幅度逐渐变小，并且呈现趋于平缓的趋势。因此，提取时间在3 h较为适宜。

（3）料液比对软枣猕猴桃多糖提取率的影响。

料液比对软枣猕猴桃多糖提取率的影响见图4。

图4 料液比对软枣猕猴桃多糖提取率的影响

随着提取溶液的增加，软枣猕猴桃多糖提取率呈明显的上升趋势；当料液比超过1∶25时，多糖提取率趋于平缓。因此，当料液比为1∶25时较为适宜。

（4）提取溶液pH值对软枣猕猴桃多糖提取率的影响。

提取溶液pH值对软枣猕猴桃多糖提取率的影响见图5。

图5 提取溶液pH值对软枣猕猴桃多糖提取率的影响

在提取溶液的pH值在7之前，随着pH值的增加，软枣猕猴桃多糖提取率不断升高；但当提取溶液的pH值升高至7之后，多糖提取率随其上升而下降。因此，提取溶液pH值在7时较为适宜。

2.1.3 软枣猕猴桃多糖提取的正交试验

（1）正交试验结果。

软枣猕猴桃多糖提取的正交试验结果与分析见表2。

由表2可知，影响软枣猕猴桃粗多糖提取率最重要的因素为提取时间（R值为3.49），其次分别为料液比、提取温度和提取溶液pH值。根据正交表中的极差分析，可以得到提取软枣猕猴桃粗多糖的最优方案为A3B2C3D1，可以从正交表中的试验结果得出，提取溶液pH值对软枣猕猴桃多糖提取率影响是最小的（R值为0.84），所以考虑到试验时间、经济成本和环境保护，试验将提取溶液pH值定为6.5～7.0，与实验室用水的pH值相近。因此，可以确定使用热水浸提法来提取软枣猕猴桃多糖的最佳提取条件为A3B2C3D1，相对应的数值为提取温度90℃，提取时间3 h，料液比1∶25，提取溶液pH值为6.5～7.0。

表2 软枣猕猴桃多糖提取的正交试验结果与分析

（2）验证试验。通过以上正交表的分析，确定了使用水浸提的方法得到的提取软枣猕猴桃多糖的最佳提取工艺参数，在此工艺参数条件下3次平行试验，所得到3次粗多糖的提取率分别为42.74%，47.39%，44.63%，其平均值为44.92%，所得值高于正交试验中各组合的提取率，即可确定A3B2C3D1为热水浸提软枣猕猴桃多糖的最佳参数工艺组合。

2.2 软枣猕猴桃多糖对酵母菌抵抗紫外照射能力的影响

软枣猕猴桃多糖的添加量对紫外照射后酵母菌数量的影响见图6。

酵母菌的数量随着粗多糖的含量上升而增加，当多糖添加量达到20%时，与空白组酵母菌数量接近，说明此时多糖的添加量起作用。可见，多糖含量对酵母菌的生长有明显影响。

3 结论

图6 软枣猕猴桃多糖的添加量对紫外照射后酵母菌数量的影响

采用热水浸提法提取软枣猕猴桃多糖，通过单因素试验和正交试验确定了软枣猕猴桃提取多糖的最佳的工艺。并研究了软枣猕猴桃多糖对酵母菌抵抗紫外线照射能力的影响。结果表明，随着软枣猕猴桃多糖含量的增加，经紫外照射的酵母存活数量逐渐增加。说明软枣猕猴桃多糖有助于酵母菌防止紫外线照射。