葡萄果皮类黄酮含量的变化及其相关基因表达

陈洪强，夏惠，王进，邓群仙，梁东，吕秀兰，唐礼平

(1.四川农业大学园艺学院，四川 成都 611130；2.广安市前锋区农业农村局，四川 广安 638019)

植物中的类黄酮化合物依据结构上的差异和生物合成的先后被分为查尔酮类、黄烷酮类、黄酮类、黄酮醇类、花色素苷类、黄烷醇类和原花色素类等7大类。类黄酮具有很强的抗氧化功能，可提高植物的抗逆性[1]，影响果蔬及其加工品的色泽和风味[2]，还具有抗菌、消炎和抑制癌细胞等功效[3–4]。类黄酮类物质来自苯丙氨酸代谢途径。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)等催化下形成4–香豆酰辅酶A，再经查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)的作用进入类黄酮代谢途径[5]。

葡萄中的类黄酮化合物主要包括花色素苷类、黄酮醇类和黄烷醇类，主要存在于果皮中[6]。花色素苷类主要存在于红(紫、紫黑、蓝)色葡萄果皮中，以花青素和花翠素的糖基化、甲基化和酰基化形式存在，一般不含天竺葵素及其衍生物。不同品种间花色苷含量及种类差异极大[7]，花色素苷的积累从果实转熟期开始直至成熟。目前已获得葡萄果皮中花色素苷生物合成途径中关键酶黄烷酮醇–4–还原酶(DFR)、无色花色素双加氧酶(LDOX)、UDP–葡萄糖–类黄酮–3–O–糖苷转移酶(UFGT)和O–甲基转移酶(OOMT)等的基因序列[8]。葡萄黄酮醇中常见的苷元主要是山柰酚、槲皮素和杨梅素等，它们的配糖体主要是以葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等组成的单糖、二糖或多糖，均为3–O–配糖体，且以3–O–葡糖基、3–O–半乳糖基和3–O–葡糖醛酸基为主。黄酮醇生物合成途径中相关基因FLS、F3H、F3’H和F3’5’H等已被克隆、鉴定，并进行了部分功能验证[9]。黄烷醇类物质是葡萄果实中重要的酚类物质之一，聚合的黄烷醇又被称为原花色素, 目前已获得与黄烷醇合成相关的无色花色素还原酶(LAR)和花色素还原酶(ANR)及其基因序列[10]。

贵州和四川近年来已成为葡萄主栽区[11]。这些地区在葡萄生长过程中面临高温、多雨、寡日照等不利生态条件，因而以避雨栽培模式为主。为探索四川地区避雨栽培条件下葡萄类黄酮物质生物合成规律，笔者以西南产区主栽的‘夏黑’葡萄为试材，测定了其果实发育过程中果皮的4种类黄酮组分含量，并分析了这些类黄酮物质合成相关基因的表达，以期丰富葡萄类黄酮在不同栽培条件下的代谢机理研究。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为四川省崇州市桤泉镇四川农业大学科研基地 4年生‘夏黑’葡萄(Vitis viniferaL.cv.Summer Black)。

1.2 方法

葡萄单干四主蔓水平棚架避雨栽培，株行距为1.5 m × 3.0 m。从葡萄谢花20 d后开始，至果实成熟(花后80 d)结束，每隔10 d(±2 d)取葡萄果实，分离果皮，用液氮速冻后保存于–80 ℃冰箱中，用于测定果皮中各类黄酮组分含量，分析相关基因表达。

1.2.1 葡萄果皮类黄酮物质的提取及组分的测定

参照文献[12]的方法，提取葡萄果皮类黄酮物质。100 mL提取液中甲醇、甲酸、无水乙醇体积比为70∶2∶28。称取果皮0.3 g，加2 mL提取液，研磨后离心，再加 3 mL提取液冲洗研钵后并入离心管。超声浸提后10 000 g离心10 min，上清液用0.45 μm的滤膜过滤后用于类黄酮物质含量的测定。

1) 总黄酮醇含量的测定。参照文献[13]的方法，略有修改。提取液、氯化铝和乙酸钠混合后孵育2.5 h，440 nm下测定吸光值。结果以槲皮素等价值表示。

2) 总黄烷醇和总原花色素含量的测定。参照文献[14]的方法，略有改动。提取液与 p–DMACA溶液混匀后在640 nm下测定总黄烷醇含量，结果以儿茶素等价值表示。提取液中加入香草醛–甲醇溶液和H2SO4–甲醇溶液，混匀后避光孵育，于500 nm测定总原花色素含量。

3) 总花色素和总类黄酮含量的测定。参照文献[15]的方法，略有改动。总花色素含量用pH示差法测量，结果以矢车菊–3–葡萄糖苷等价值表示。总类黄酮含量以芦丁等价值表示。

1.2.2 葡萄果皮RNA提取与基因表达分析

葡萄果皮总 RNA的提取参照 RNeasy Plant Mini Kit试剂盒(Qiagen)使用说明书进行。采用DNase I降解 RNA中存留的 DNA。用 Nanodrop ND–2000 spectrophotometer(Thermo)进行定量。利用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒(Takara)进行反转录，各基因引物如表1所示。反转录结束后按照 SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒(Takara)在荧光定量PCR仪上进行Real–time RT–PCR扩增。扩增结束后数据分析采用2–ΔΔCt法，重复3次。以EF1ɤ和GAPDH为参照基因。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

2 结果与分析

2.1 葡萄果皮中类黄酮物质含量的变化

葡萄果实发育过程中果皮类黄酮物质含量测定结果列于表2。花后21 d时，葡萄果皮中的总黄酮醇含量最高，随后含量下降，至花后52 d下降至最低，花后 52～69 d的含量基本保持不变，花后69～80 d再次升高。总黄烷醇含量和总原花色素含量的变化趋势相似，均从花后21 d开始增加，直至花后42 d时达到最大值，随着果实进入转色期(花后40～50 d)含量下降，之后含量变化不大。

果实进入转色期之前，几乎检测不到总花色素含量，从花后42 d起，含量逐渐增加，花后60～80 d是快速增长期，在果实完全成熟时达到最高值，是花后42 d时的15倍。花后21～31 d，总类黄酮含量逐渐下降，随后又升高，之后随着果实进入转色成熟期逐步下降，花后69～80 d 又有1次小幅升高，低于果实发育早期时的含量。

表2 葡萄果皮类黄酮物质的含量Table 2 The content of flavonoids in grape peel mg/g

2.2 类黄酮物质生物合成相关基因的表达

采用实时荧光定量RT–PCR分析葡萄果皮中类黄酮生物合成相关基因的表达，结果如图1所示。PAL1在果实生长初期表达水平快速上升，至花后31 d达到最高值，随后表达水平快速下降，但在成熟时再次升高；果实生长初期PAL2表达水平较低，后随果实成熟逐渐升高。进入转色期前，CHS2表达水平一直下降，后随果实成熟逐渐升高；CHS3和CHI2表达随果实生长至花后60 d时达到最高水平，随后降低；CHI1的表达水平随果实成熟逐渐升高；F3H随果实成熟表达逐渐下降；F3’H在幼果期表达水平迅速上升，而后下降，随成熟再次上升；F3’5’H、LDOX、UFGT、OMT和FLS的表达水平均是果实生长中后期高于前期；DFR的表达水平在花后31 d左右达到最高，随后迅速下降，但又随果实成熟逐渐升高；LAR1、LAR2和ANR的表达相似，均是在果实生长早、中期较高，后随果实成熟下降。

3 讨论

DOWNEY 等[16]测定了‘Shiraz’和‘Chardonnay’葡萄果实生长过程中黄酮醇含量的变化，发现坐果初期和果实成熟期是黄酮醇主要的积累时期，转色期黄酮醇含量非常低。FANG等[17]也发现‘Cabernet Sauvignon’葡萄的幼果期和成熟期是总黄酮醇和单体黄酮醇的主要积累时期。本研究结果也发现了同样的趋势，而且还发现黄酮醇生物合成的关键基因FLS的表达与黄酮醇含量的变化趋势一致。这可能是因为葡萄果实发育的早期由于碳水化合物含量比较低，限制了花色素苷的生物合成，因此，花色素苷和黄酮醇生物合成的共同底物二氢黄酮醇更多地流向了黄酮醇生物合成方向[16–17]。

BOGS 等[10]的研究发现，从‘Shiraz’葡萄开花起，原花色素就开始积累，随后持续增加直至果实转熟期。FUJITA等[18]和CADOT等[19]的研究也发现，葡萄果实中黄烷–3–醇类物质的积累主要是在葡萄进入转色期前，而后伴随着葡萄果实的成熟呈现下降趋势。本研究中，发现黄烷醇和原花色素含量均在花后21～42 d时增加，后随果实进入转色期含量显著下降，进入成熟期后含量基本不再变化或略有下降。虽然黄烷醇和原花色素含量在果实生长过程中的变化趋势略有不同，但总体上可以看到，幼果期黄烷醇和原花色素含量显著高于成熟期。这可能是因为幼果期花色素苷类化合物基本不合成，无色花色素和花色素单体在LAR和ANR的催化下更多地转变为黄烷醇或者原花色素，但进入转色成熟期后，无色花色素和花色素单体便主要用于花色素苷的生物合成了。本研究中LAR2和ANR的表达趋势与 BOGS等[10]在‘Shiraz’葡萄果皮中的研究结果较为一致，但LAR1表达趋势差异较大，这可能与葡萄品种和栽培环境有关。

从本研究的结果来看，幼果期(花后 21～42 d)和果实成熟后期(花后 69～80 d)是类黄酮类化合物主要的积累时期，这与以往研究[17,20]的发现是一致的。幼果期是葡萄果实生长的第1个快速期，这一时期果实细胞大量分裂和膨大，并伴随着强烈的呼吸作用和新陈代谢，导致包括类黄酮化合物在内的各种代谢产物迅速积累。成熟期是葡萄果实快速生长的另一时期，碳水化合物和各种营养物质大量积累，可能使类黄酮类化合物再次积累，但由于细胞内含水量较高，因而积累量反不如幼果期。另外，类黄酮类化合物与植物的抗逆性密切相关。相比于转色期和成熟初期充足的水分条件，葡萄果实在幼果期时雨水较少，而成熟后期一般都会人为控水以促成熟，从而使葡萄受到一定程度的干旱胁迫，因此，葡萄果实也可能会合成更多的类黄酮化合物。

图1 葡萄果皮类黄酮生物合成基因的相对表达水平Fig.1 Relative expression level of genes involved in flavonoid biosynthesis in developing grape berries