上皮-间质转化诱导转录因子在肺癌诊断和预后预测中的作用

复旦大学附属肿瘤医院麻醉科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

肺癌是全球人群中发病率最高的肿瘤（占所有肿瘤的11.6%），其死亡率也位居各类肿瘤之首（占18.4%）［1］。目前，手术治疗仍是中早期肺癌治疗的首选方法，但仍有许多患者丧失手术机会或在术后出现复发和转移，因而早发现、早诊断、早治疗在肺癌的诊治中至关重要。对于部分无法手术或术后出现复发和转移的患者，分子靶向治疗作为新的治疗手段取得了良好的效果，正越来越受到重视。与传统化疗相比，靶向药物具有特异性强、疗效明显、不良反应较少等优点［2］。然而，靶向药物仅适用于目标基因有突变的患者，且治疗一段时间后，大多数患者对靶向药物产生耐受。这表明，肺癌复发转移的机制异常复杂，有必要进一步探索肺癌细胞的迁移和侵袭机制，以寻找更好的生物标志物，为肿瘤治疗、靶向药物的研发提供理论支持。

近年来，越来越多的研究发现，上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）介导了肿瘤的转移、复发和肿瘤耐药［3］。在EMT过程中，表皮表型的肿瘤细胞失去细胞极性和细胞间的紧密连接，转化为没有细胞极性且迁移侵袭能力较强的间质表型。此外，EMT还受到Twist家族BHLH转录因子1（Twist family BHLH transcription factor 1，Twist1）、Twist2、Snail超家族锌指转录因子（Snail family zinc finger，SNAI）1、SNAI2、锌指E盒同源结合蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）、ZEB2等转录因子的调控，它们常被视作EMT的生物标志物，可统称为EMT诱导转录因子（EMT-inducing transcription factor，EMT-TF）［3］。研究发现，EMT还可激活肿瘤干细胞，导致耐药［4］。因此研究EMT-TF在肺癌中的作用有助于肺癌的病理诊断与预后分析。

Twist1和Twist2是碱性的螺旋-环-螺旋蛋白（basic helix-loop-helix protein，bHLH）家族中的两个重要转录因子。在多种肿瘤中，Twist1呈现高度甲基化，且表达明显增加［5］，它可通过调控EMT促进肿瘤的增殖和转移［6］。此外，Twist1还可通过诱导EMT、激活肿瘤干细胞，致使多种肿瘤对靶向药物发生耐受［7-9］。然而，与Twist1相反，Twist2对肿瘤有明显的抑制作用，它在多种肿瘤组织中，无论是mRNA水平还是蛋白水平都有明显的下降［10］。ZEB家族在激活肿瘤干细胞、调控肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤血管生成和化疗药耐药等方面发挥着重要作用，因而有可能成为肿瘤诊断、预后分析以及治疗的靶点［11］。ZEB家族有两个重要转录因子ZEB1和ZEB2，它们主要在细胞核内发挥作用。SNAI是保守的锌指家族的转录因子之一，它对果蝇中胚层的形成至关重要［12］。SNAI在转录水平受到很多生长因子和信号分子的调节，这些因子通过结合SNAI基因的启动子区域发挥调控作用［13-14］。SNAI1能够与组蛋白去乙酰化酶HDAC1/2相互作用，通过改变染色质的局部结构，抑制E-cadherin的表达，进而调节EMT［15］。随着研究的深入，人们越来越关注EMT-TF在肿瘤转移复发中的作用，但目前有关EMT-TF与肿瘤分期、预后预测方面的研究很少，因此我们期望利用肿瘤在线数据库，筛选对肺癌诊断、分期和预后预测方面有一定价值的转录因子。

1 材料和方法

1.1 Oncomine Database分析、GEPIA和Lung Cancer Explore

Oncomine Database数据库中共有肺癌数据集74个，包括6 289个样本，我们通过Oncomine Database分析EMT TF在不同肿瘤中的表达水平，进而分析EMT TF在肺癌组织和正常组织中的表达差异（cut-off值：P=0.01，fold change of 2）。GEPIA公共在线数据库包含TCGA数据库中9 736例肿瘤标本以及GTEx数据库8 587例正常组织样本［16］。我们应用GEPIA比较了EMT-TF基因在肺癌（肺腺癌和鳞状细胞癌）和正常组织中的表达差异，同时还将分析EMT-TF mRNA表达水平与肿瘤临床病理学分期的相关性。

1.2 Kaplan-Meier Plotter

Kaplan-Meier Plotter能够检测近54 000个基因对21种肿瘤生存预后的影响［17］。我们应用Kaplan-Meier Plotter Lung Cancer数据库分析EMT TF mRNA水平对肺癌患者5年生存率的影响，例如总生存期（overall survival，OS）、无进展生存期（progression-free survival，PFS）、进展后生存期（post-progression survival，PPS）。

1.3 STRING和Mentha数据库

STRING数据库收集了目前研究的蛋白质间的相互作用，我们通过多基因分析筛选了EMTTF的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。Mentha数据库的数据来自于依附IMEx联盟的人工管理的PPI数据库，聚集的数据为科研工作提供了一系列工具，在PPI网络的背景下分析选定的蛋白质。通过Mentha数据库，分析EMT-TF相互作用的系数以及与之作用的分子。

2 结果

2.1 EMT-TF在肺癌组织中的表达水平

应用ONcomine数据库，我们对比了多种肿瘤组织和正常组织中EMT-TF的转录水平（图1），并将肺癌有关的结果单独归纳于表1。在Hou肺癌数据库中，鳞癌、腺癌组织中Twist1 mRNA水平分别是正常组织的7.7倍和2.54倍，其差异有统计学意义（P＜0.01）［18］。在包括Hou等［18］报道的数据库在内的4个肺癌数据库中，鳞癌SNAI2转录水平均显著高于正常组织：Yamagata数据库中，SNAI2转录水平增加2倍［19］；Wachi等［20］和Hou等［18］报道，SNAI2转录水平增加3倍多；Garber数据库中［21］，SNAI2转录水平增加4倍多，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图1 EMT-TF在不同肿瘤中的转录水平Fig.1 Transcription level of EMT-TF in different types of cancer

表1 EMT-TF转录水平在肺癌和肺组织中的改变Tab.1 The significant changes in transcription level of EMT-TF between different types of lung cancer and normal tissues

2.2 EMT-TF的mRNA表达与肺癌临床病理学分期的关系

通过搜索基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库比较了EMT-TF在肺癌组织和正常组织中的表达差异。结果显示，与正常组织相比，在肺鳞癌中Twist1和SNAI2 mRNA表达增加，Twist2、ZEB1、ZEB2和SNAI1表达降低；而在腺癌中，Twist2、ZEB1、ZEB2和SNAI1 mRNA表达水平降低，Twist1、SNAI2 mRNA表达无差异（图2A）。

为探究EMT-TF的表达水平与肿瘤分期的相关性，我们采用stage plot方法对GEPIA数据进行了分析，结果显示，Twist1、SNAI1和SNAI2表达水平与肺癌临床病理分期具有明显相关性，而Twist2、ZEB1和ZEB2的表达水平与临床病理学分期无相关性（图2B）。

2.3 Twist1与肺癌患者预后相关

我们采用Kaplan-Meier Plotter工具分析了EMT-TF mRNA水平与肺癌5年生存率之间的关系，结果发现，Twist1和Twist2的表达增加提示肺癌患者的不良预后（P＜0.05）：例如Twist1、Twist2高表达组患者OS、PFS均较低（P＜0.05），SNAI1高表达组患者PFS、OS和PPS均较低（P＜0.05），ZEB1、ZEB2低表达与肺癌的不良预后相关，其中ZEB1的表达降低与肺癌OS降低相关，ZEB2的低表达与肺癌的PFS和OS预后不良显著相关（图3）。

2.4 EMT-TF的相互作用及通路

我们首先采用STRING分析了EMT-TF之间的PPI，结果显示，EMT-TF之间存在直接或间接的相互作用，其中Twist1和Twist2在信号网络中起关键作用（图4A）。随后，我们采用Mentha数据库进一步展示了TF之间的相互作用以及与它们相互作用的分子，并且显示了分子作用的部位（图4B）。KEGG通路分析发现，EMT-TF受到细胞外界微环境的变化，如细胞因子等的调控，发挥促进肿瘤迁移和侵袭的作用，进而导致转移的发生。

图2 EMT-TF的mRNA水平以及与肺癌临床病理分期的关系Fig.2 The association of EMT-TF mRNA transcription level and tumor stage in lung cancer patients

图3 EMT-TF与肺癌预后的相关性Fig.3 The correlation of EMT-TF expression level and prognosis of lung cancer patients

图4 PPI和EMT-TF相互作用的分子Fig.4 PPI network of EMT-TF and the cofunction molecules

3 讨 论

EMT是肺癌侵袭和转移的重要环节，非小细胞肺癌患者可通过EMT机制对肿瘤治疗药物产生耐药。研究发现，TGF-β可通过下列途径介导EMT：①通过Smad途径介导EMT；② 通过诱导Smad复合体浸入细胞核进而调节EMT相关基因和因子的表达；③可增加SNAI1、SNAI2和ZEB1/2等EMT-TF的表达［22］。LncRNA也能通过影响EMT的进程和肿瘤干细胞特性，发挥调节非小细胞肺癌转移的作用［23-24］。研究表明，miRNA也能调控EMT，如抑癌因子miR-451a的过表达可破坏肺癌细胞的EMT，显著增强肺癌细胞对多柔比星治疗的敏感性［25］。在肺癌中，很多促癌基因也能促进EMT，比如FAM83D［26］、FOXK1［27］、KLK4［28］等。因此识别并阻断EMT进程，对降低肿瘤的侵袭和转移非常重要，同时也可降低进展期肺癌患者的负荷，进而提高对手术的耐受和预后，这对肺癌乃至所有肿瘤患者都很重要。

研究发现Twist1在肺癌中受很多因素的调节，如LncRNA JPX上调Twist1后通过Wnt/β-catenin信号通路诱导EMT和肺癌细胞侵袭［29］；HR23A与Twist1相互作用促进了Twist1的泛素介导的蛋白酶体降解，从而抑制了EMT、癌细胞迁移和干细胞特性［30］；此外还包括表观遗传相关分子和miRNA。目前对Twist2的研究寥寥无几，并且对其在肺癌中的作用并无明确一致的观点［31-32］。本研究发现Twist1在肺癌中的表达增加，并且与肺癌的临床病理学分期相关，Twist1表达增加提示肺癌患者的不良预后，以上皆提示Twist1在肺癌诊断和研究中的重要性和作为肺癌潜在标志物的可能。

SNAI1是一种重要的EMT-TF，可以促进肿瘤的转移，从机制上讲，SNAI1向其目标启动子招募多个参与组蛋白去乙酰化、甲基化和泛素化的抑制蛋白复合物，并发挥其抑制功能［33］。临床上发现，SNAI1的表达和化疗耐药、生存率降低、复发率较高和预后较差相关［15，33-34］。然而SNAI1是不稳定的，通过泛素化介导的蛋白酶体途径很快被降解，通过稳定SNAI1能够促进肺癌细胞的迁移［33］。肿瘤在线数据库分析发现SNAI1在肺癌组织中的表达低于正常组织，并且与分期密切相关，但其预后和在肿瘤中的表达存在分歧。目前对于SNAI1的研究甚少，SNAI1在肺癌中降低的机制，以及它调控的基因仍有待进一步探讨；同时我们分析不同的研究存在样本的差异，以及临床数据收集样本的特异性等，使得无法对其原因进行深入分析。

ZEB1/2的作用相似，在肺癌中，各种调节因子通过作用于ZEB1/2的启动子，调节它们的表达，进而调节EMT和肺癌的侵袭和转移［35-37］。ZEB1/2通过数据库分析发现其表达水平在肺癌中降低，但和临床病理学分期无相关性，ZEB1/2表达降低与患者的不良预后相关。同时EMT-TF在肺癌中的作用逐渐明了，本研究也发现了其与肺癌分期和预后的相关性，这可能辅助于临床诊断、分期和预后预测，同时未来的研究需要进一步探索外界及肿瘤微环境中调节EMT-TF的因子，为肿瘤的预防和治疗提供理论依据。

Twist1、SNAI2、ZEB1和ZEB2在肺癌中的表达量和正常组织不同，Twist1和SNAI2的表达量与肿瘤的分期与预后相关，ZEB1和ZEB2在肺癌中表达量降低与肺癌患者的预后不良相关。因此，Twist1和SNAI2可能是肺癌诊断和研究的潜在的生物标志物，ZEB1和ZEB2可作为肺癌预后的预测分子。