奶水牛ACSL1 基因组织表达分析及其对脂肪酸代谢相关基因表达的影响

梁莎莎，庞春英，邓廷贤，马小娅，陆杏蓉，段安琴，梁贤威

（中国农业科学院广西水牛研究所，农业部（广西）水牛遗传繁育重点实验室，广西南宁 530001）

水牛奶营养丰富，其乳脂肪、乳蛋白等主要营养物质均高于牛奶或人奶[1]，被誉为“奶中之王”。乳脂是乳中重要组成成分，由约98%的甘油三酯和约1%的磷脂、少量的1,2-甘油二酯、胆固醇和游离脂肪酸等组成[2]。长链脂酞辅酶A 合成酶家族（Long-Chain Fatty Acyl-CoA synthetases，ACSLs）是哺乳动物利用脂肪酸活化催化生成酯酰辅酶A 过程中所必需的酶[3]。现已发现哺乳动物ACSLs基因有5 种亚型，分别为ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6[4-5]。研究表明，ACSLs基因在甘油三酯、磷脂和胆固醇合成及脂肪酸代谢中具有重要作用[6]。Suzuki 等[7]和Abe等[8]研究发现高碳水化合物或高脂肪日粮会对ACSL1在肝脏中的表达产生影响。Hendrik 等[9]研究发现，ACSL1在出生后至成年过程中的表达量逐渐增加。在HepG2 细胞中，过表达ACSL1导致细胞内甘油三酯含量增加了40%，并且长链脂酞辅酶A 含量也增加了60%[10]。因此，ACSL1基因过表达后可以提高甘油三酯中油酸的沉积，增加脂肪在细胞内的沉积量[3]，而脂肪的沉积可影响奶的风味[11]。鉴于此，探究ACSL1基因对脂代谢相关基因表达水平的影响对未来生产出高品质水牛奶具有重要意义。本实验利用基因操作技术克隆出水牛ACSL1完整CDS 序列并构建过表达载体和干扰片段，从而探究该基因对乳腺上皮细胞中乳脂代谢相关基因表达的影响，为今后进一步研究该基因在奶水牛乳腺脂肪酸代谢中的功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 3 头48 月龄、体重约500 kg 的雌性泌乳期尼里水牛来自广西水牛研究所种畜场，原代分离和培养的乳腺上皮细胞来自本实验室。

1.2 主要试剂 骨架载体PCDNA3.1+、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、DMEM/F-12 细胞培养基、Lipofectamine 3000、Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂和PowerUp SYBR Green Master Mix 购自Thermo 公司；普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；PEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 购自北京全式金生物科技有限公司；PureLink RNA Mini Kit、PremixTaq酶购自TaKaRa 公司，siRNA 干扰片段委托广州锐博生物科技有限公司制备（表1）。

表1 siRNA 序列

1.3ACSL1不同组织表达量检测 将水牛的共8 种组织的cDNA 稀释至70～80 ng/μL，使用实时荧光定量PCR检测ACSL1在不同组织中的表达情况，以GAPDH作为内参。反应体系为20 μL，其中PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，Rnase water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL；反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 个循环。

1.4ACSL1基因编码区克隆及过表达载体构建 采用一步克隆法设计引物，以NCBI 上预测的水牛ACSL1基因（登录号：XM_006075115.2）为参考序列，以pcDNA3.1+为骨架载体，选取NotⅠ为酶切位点，扩增引物：F:5´-ATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCATGATGCAA GCCCACGAGC-3´；R：5´-GCCCTCTAGACTCGAGCG GCCGCTTAGACTTTGATGGTGGAG-3´。大体上讲，以水牛乳腺组织cDNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 反应体 系50 μL：DNA 模 板1 μL，PremixTaq25 μL，上、下游引物各2 μL，dH2O 20 μL；PCR 反应程序：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 个循环，72℃延伸8 min。取10 μL PCR 产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，对目的片段进行胶回收后，产物与pcDNA3.1+载体连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经筛选挑菌培养后，委托华大基因进行测序。

1.5 水牛乳腺上皮细胞培养与转染 细胞培养液为DMEM+10%FBS，转染前24 h，将水牛乳腺上皮细胞均匀接种于24 孔培养板中，待细胞密度达到约80%时，使用Lipofectamine 3000 转染ACSL1过表达载体，使用Lipofectamine RNAiMAX 转染siRNA，具体步骤参照试剂盒说明书进行。本实验设置过表达载体组（Ad-ACSL1）、过表达载体对照组（Ad-pcDNA3.1+）、干扰组（siRNA-ACSL1）和干扰对照组（siRNA-NC）4个处理组，每个处理组设置3 个重复，每个重复设置3个孔。

1.6ACSL1过表达及干扰对脂代谢相关基因表达水平的影响检测 细胞转染48 h 后收集，用PureLink RNA Mini Kit 试剂盒提取总RNA，通过电泳检测RNA 的浓度和完整性，再使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录实验，反转录体系：RNA 模板1 μL，nuclease-free water 10 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，dNTP Mix 2 μL，RiboLock 1 μL，RevertAid 1 μL，Oligo(dT) 1 μL，42℃ 60 min，cDNA 保存于-80℃。

用Primer 3.0 在线软件设计脂代谢相关基因，其引物序列见表2。qPCR 反应体系为20 μL：PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，Rnase water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL；反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，40 个循环。

表2 实时定量PCR 引物

1.7 统计分析 使用GraphPad Prism 7 软件对实验结果进行分析及作图，运用t检验对实验数据进行显著性分析。将P≤0.05 作为显著性水平。

2 结果

2.1 水牛ACSL1基因组织表达分析 由图1 可知，水牛ACSL1基因在乳腺组织中的表达量显著高于其他组织，其他组织的表达量从高到低依次为乳腺、淋巴、肝、心、大肠、肾、肺、垂体、子宫、输卵管、卵巢、脾和大脑。

2.2 水牛ACSL1基因CDS 序列克隆及过表达载体构建以水牛乳腺组织cDNA 为模板，进行PCR 扩增，产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，出现了1 个单一DNA条带，片段大小为2 100 bp，与预测的片段大小一致（图2），经测序后与模板序列比对，相似性达99.95%；以pcDNA3.1+为骨架载体，选取NotⅠ为酶切位点进行酶切，连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经筛选挑菌培养后提取质粒（图3）。

2.3ACSL1过表达对脂代谢相关基因的影响 如图4 所示，与对照组（Ad-pcDNA3.1+）相比实验组（Ad-ACSL1）细胞中ACSL1表达量极显著上升(P＜0.001)。细胞转染ACSL1过表达载体与对照组差异极显著。由图5 可知，ACSL1基因过表达后，细胞中CLIC1、ELOVL1和PNPLA2等3 个基因显著上升、ELOVL6表达量则极显著上升，而CPT1B、CPT1C和DDR1表达量极显著上升（P＜0.001），但FADS2差异不显著。

2.4ACSL1干扰对脂代谢相关基因的影响 如图6 所示，与对照组（siRNA-NC）相比，实验组（siRNA-ACSL1）细胞中ACSL1表达量极显著下降(P＜0.01)。细胞转染ACSL1干扰片段及其对照后的表达情况。由图7 可知，ACSL1基因敲低后，细胞中ELOVL1和FADS2表达量显著下降，而CLIC1、CPT1C、ELOVL6、DDR1和PNPLA2表达量极显著下降，但CPT1B差异不显著。

3 讨 论

长链酯酰辅酶A 合成酶家族（ACSLs）是脂肪酸代谢中至关重要的酶，它们以长链脂肪酸（C12-C22）、ATP 和COA 作为底物，生成长链酯酰辅酶A 酯而参与各种脂类代谢[12]。ACSLs 基因家族的成员在不同组织中的表达及作用各不相同[13]，ACSL1一般在与能量代谢有关的组织（如肝脏、脂肪和肌肉组织）中高表达[14]，在对人HepG2 细胞、小鼠原代肝细胞、肝脏组织、脂肪细胞以及脂肪组织的研究中发现，过表达ACSL1有助于脂肪酸转运和甘油三酯的沉积[15-17]，并且ACSL1是脂酰CoA 合成甘油三酯最重要的合成酶[14]。Bionaz 等[18]发现，ACSL1基因奶牛泌乳高峰期乳腺中的表达量极显著上升，乳汁中甘油三酯水平也急剧上升。本研究的组织表达分析结果也进一步显示，该基因在乳腺组织中的表达量最高，暗示该基因可能与泌乳期水牛乳脂合成有关。

在奶牛乳腺组织中，乳脂合成的主要过程为脂肪酸的分解与摄入、脂肪酸的激活与转运、脂肪酸的合成、三酰甘油的合成、乳脂滴形成和乳脂合成相关的调节因子[19]。CPT1B和CPT1C是CPT1家族中十分重要的成员，CPT1B参与脂肪酸的分解供能调控，CPT1C是脂肪酸分解代谢主要途径β-氧化的限速酶[20]，CPT1能催化脂酰辅酶A 生成脂酰肉毒碱，通过调节长链脂肪酸进入线粒体进行β-氧化，从而为机体提供能量，并减少脂肪沉积[21]。过表达ACSL1后，CPT1B基因表达量均极显著上升，因此推测，在水牛乳脂合成过程中，随着ACSL1表达量上升，有可能使脂肪酸分解供能的活动增加。FADS2是多不饱和脂肪酸合成过程中的限速酶，敲除FADS2基因小鼠体格比野生型小鼠小10%～15%，体重瘦20%～25%[22]。本研究同时也发现干扰ACSL1后，FADS2表达量显著下降。由此推测，随着ACSL1基因表达量下降，有可能影响多不饱和脂肪酸的合成。DDR1的功能与生长发育有关，是乳腺导管形态发生过程中结构上皮的关键介质，DDR1基因敲除小鼠表现为胚胎植入和乳腺发育缺陷[23]。CLIC1参与细胞跨膜物质的运输，ELOVL1和ELOVL6参与脂肪酸的延伸，PNPLA2作用于催化脂肪细胞中甘油三酯脂解的起始步骤，将甘油三酯转化为二酰甘油，PNPLA2基因敲除的小鼠由于脂肪细胞甘油三酯水解的速率受损，脂肪组织质量增加[24]。本研究中，无论过表达或干扰ACSL1，CLIC1、CPT1C、ELOVL1、ELOVL6、DDR1和PNPLA2的表达量都随之极显著上升和下降。因此推测，ACSL1在乳腺上皮细胞的表达量多少有可能影响水牛乳腺的生长发育状况、水牛乳脂合成过程中乳腺细胞跨膜物质运输、脂肪酸分解代谢、减少脂肪酸延伸，降低细胞中甘油三酯水解速率。综上所述，ACSL1基因可影响水牛乳腺上皮细胞中部分脂代谢相关基因的表达量变化，从而影响水牛乳腺上皮细胞甘油三酯的合成。

4 结 论

本实验成功构建了水牛ACSL1过表达载体并合成了干扰片段。组织表达分析结果显示水牛ACSL1基因在乳腺组织中的表达量最高；在乳腺上皮细胞中过表达和干扰ACSL1后结果显示，ACSL1基因可影响水牛乳腺上皮细胞中部分脂代谢相关基因的表达量变化。本研究为进一步探讨水牛及其他物种ACSL1基因的功能提供了理论基础。