苯磺隆对两株木霉的毒力测定

郎剑锋,陆宁海,赵荣艳,石明旺

（河南科技学院资源与环境学院,河南新乡453003）

木霉是土壤微生物区系的重要组成部分,由于其具有生长和繁殖快、对人畜安全[1],可对多种植物病原菌具有拮抗活性[2]而受到人们的广泛关注.目前市面上已有多种木霉菌剂问世,多为活的孢子菌剂,但由于其对环境条件变化敏感而限制了推广和应用,尤其是化学药剂对其的影响更受关注.国内外多名学者研究了不同化学药剂（包括化学农药、肥料[3]及重金属离子[4]等）对木霉生长的影响.陈建爱等[5]发现不同生态环境对木霉生存影响很大,有农药、化肥污染的土壤中木霉的菌量少.Santoro 等[6]研究发现异恶草酮、2,4-D 和咪唑烟酸对深绿木霉具有最小的毒性,可以与木霉共同使用.程东美等[7]研究了5 种常见的土壤除草剂对哈茨木霉T2 菌株的影响,发现苄·甲磺隆对哈茨木霉的菌丝生长和孢子萌发均有强烈的抑制作用,氟乐灵也有较强的抑制作用,结果表明莠去津可以与哈茨木霉同时使用或混用,苄·甲磺隆使用后短期内不应使用木霉.郎剑锋等[8]研究了8 种常见的除草剂对哈茨木霉的影响,结果表明哈茨木霉在田间施用时,应避开与木霉的共同使用.成元刚等[9]研究了6 种除草剂对哈茨木霉的影响,发现苯磺隆或百草枯对木霉影响较小.前面所述研究采用的大多为高营养的PDA 培养基,而在低营养培养基下环境条件对木霉的影响如何,目前报道较少,而木霉在田间施放,却是处在一个低营养的环境中.因此本研究选用土壤浸渍液培养基为基础培养基,以苯磺隆为供试农药,以拟康木霉菌株St-zn-9 和St-zn-9r作为供试菌株,采用含毒介质培养法,研究大田常用除草剂苯磺隆对木霉菌丝生长和产孢量的影响,旨在评估苯磺隆对木霉的毒力大小,为今后木霉菌剂的开发和田间应用奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试拟康木霉（Trichoderma pseudokoningii）菌株St-zn-9 和St-zn-9r由河南科技学院植物病理实验室提供,其中菌株St-zn-9r为木霉菌株St-zn-9 经紫外诱变后对腐霉利有抗性的菌株.

1.1.2 供试农药10%苯磺隆可湿性粉剂,潍坊卓尔农化有限公司.

1.1.3 培养基 供试基础培养基选用改良的土壤浸渍液固体培养基,配方为：土壤200 g,秸秆200 g,琼脂15 g,水1 000 mL,pH 自然.土壤采自河南科技学院小麦试验田耕作层土壤,土壤类型为壤土,秸秆为小麦秸秆.配制方法为：土壤及秸秆煮沸30 min 后,静置,过滤取上清液,加入琼脂,121 ℃灭菌30 min 后备用.

1.2 试验方法

1.2.1 培养温度选择 选择在木霉生长最好的28 ℃下进行试验.

1.2.2 苯磺隆对木霉菌丝生长及产孢量的影响 采用含毒介质培养法[10],将苯磺隆加入到培养基中,根据预试验结果,使培养基中苯磺隆质量浓度分别达到600、1 000、2 000、3 500、5 000 和6 500 mg/L 的含药培养基,然后将活化好的木霉菌种菌饼（d=5 mm）放置于固体平板中央,于恒温箱中28 ℃培养72 h 后,采用十字交叉法测量菌落直径,计算抑制率.待对照菌落完成变绿后,用血球计算板测量木霉产孢量,计算产孢抑制率.以未含药培养基的木霉生长情况作为对照.

1.2.3 数据处理 以质量浓度对数为横坐标, 菌落直径生长抑制率转化的机率值作为纵坐标, 通过Excel 2010 求毒力回归方程y=a+bx,相关系数R2,抑制中质量浓度EC50.把抑制率转化为反正弦后利用SPSS 16.0 软件对数据进行Ducan 氏新复极差法多重比较.

2 结果与分析

2.1 对两株木霉菌丝生长的影响

不同质量浓度苯磺隆对木霉菌丝生长的影响结果见表1.

表1 不同质量浓度苯磺隆对木霉菌丝生长的影响Tab.1 Effects of Bensulfuron-methyl at different concentrations on the hyphae growth of Trichoderma

由表1 可知,不同质量浓度的苯磺隆对两个木霉菌株均具有抑制作用.在低质量浓度（600 mg/L）时抑制率均小于10%,随着质量浓度的增加,抑制率随之增加.不同质量浓度之间均达到极显著差异.从菌落直径来看,St-zn-9 的菌落直径明显小于St-zn-9r,说明St-zn-9r在土壤中具有更好的生存能力,苯磺隆对木霉的抑制率St-zn-9r在各个质量浓度均小于St-zn-9,说明St-zn-9r对苯磺隆具有更高的抗性.

以质量浓度对数为横坐标,以几率值作为纵坐标可得到两个菌株的毒力回归方程（见表2）.据毒力回归方程计算出苯磺隆对木霉St-zn-9 和St-zn-9r的EC50分别为2 836.432 5 mg/L 和3 650.561 1 mg/L,进一步说明突变菌株St-zn-9r对苯磺隆具有较高的抗性.

表2 苯磺隆对木霉菌株的毒力分析Tab.2 Toxicity analysis of bensulfuron-methyl to Trichoderma strains

2.2 对两株木霉产孢量的影响

不同质量浓度苯磺隆对木霉产孢量的影响结果见表3.

表3 不同质量浓度苯磺隆对木霉产孢量的影响Tab.3 Effects of Bensulfuron-methyl at Different Concentrations on sporulation of Trichoderma

由表3 可知,苯磺隆对两株木霉均有较强的抑制能力.其在低质量浓度（600 mg/L）下对两株木霉产孢量的抑制率均超过了40%.且随着质量浓度的增加对产孢量的抑制能力也在增加.

3 结论与讨论

土壤微生物作为土壤健康的指示剂[11],化学农药对土壤微生物的生长具有负面或正面的影响.如龚明等[12]发现甲胺磷对土壤微生物总量不会有显著变化,但会使真菌丰度下降和细菌种群上升而达到一种动态平衡.孙淑清等[13]发现不同微生物对除草剂的敏感性存在差异.长期大量使用化学药剂,易造成农药残留,有害生物再猖獗和抗药性,通过使用微生物农药,代替或部分代替化学药剂,可降低田间化学药剂喷洒数量,但微生物农药使用过程中会受到化学药剂的影响.微生物农药和生防菌剂协同控制植物病害成为热点之一[14-15].苯磺隆主要用于防治一年生阔叶杂草,施放到土壤中对土壤真菌具有强烈的抑制作用[16].木霉作为一种土壤微生物中的重要种群,研究苯磺隆对其毒性大小具有重要意义.

本研究结果表明,不同质量浓度的苯磺隆对木霉菌丝生长和产孢量均有抑制作用.对菌丝生长的毒力回归分析表明,苯磺隆对两种菌株的毒力不同,EC50分别为2 836.432 6 mg/L 和3 650.561 1 mg/L,突变菌株St-zn-9r对苯磺隆具有更高的抗性.杨正军等[17]以《化学农药环境安全评价试验准则》作为参考,将农药对木霉的毒性划为四个等级,其中当EC50≥200 mg/L 时为低毒,本试验中苯磺隆对两株木霉菌丝生长的EC50已经远远大于该参考标准.而且苯磺隆在田间使用的推荐质量浓度为400～600 mg/L,本试验中在600 mg/L 时苯磺隆对木霉的抑制率在6.00%和8.30%,如仅考虑菌丝生长的话,苯磺隆对木霉的抑制能力并不高.但苯磺隆对木霉产孢量的研究中,在低质量浓度（600 mg/L）时苯磺隆对两株木霉产孢的抑制率就均达到了40%,且随苯磺隆质量浓度升高抑制率升高,在高质量浓度（6 500 mg/L）时,对St-zn-9产孢量的抑制率达到了94.99%,对St-zn-9r的抑制率也达到了78.90%.因此,综合考虑苯磺隆对木霉菌丝生长和产孢量的影响,建议在田间使用苯磺隆时,应避开与木霉的同时施放.

成元刚等[9]对苯磺隆对木霉菌丝生长和产孢量的研究中,得出苯磺隆的EC50为13 556.342 mg/L,而本试验中苯磺隆对木霉St-zn-9 和St-zn-9r的EC50分别为2 836.432 6 mg/L 和3 650.561 1 mg/L,只是相当于其EC50的20.93%和26.93%.分析可能是由于供试菌株和培养基的不同导致.不同的菌株对农药的抗性是不同的[18],而在高营养培养基和低营养培养基上农药对其的抑制能力也是不同的,在低营养的培养基上化学药剂对其有更高的毒性[3].本试验所采用的改良的土壤浸渍液培养基,更接近于大田实际,所得结果有利于指导今后的农业生产.

目前利用诱变产生对农药有抗性的菌株多有报导[19,20].本研究所选的木霉St-zn-9r菌株,为原始菌株St-zn-9 经紫外诱变后对腐霉利有抗性的菌株,结果也表明,该诱变菌株较原始菌株对苯磺隆同样具有更高的抗性,说明紫外诱变后木霉对苯磺隆产生交互抗性.分析可能是由于经诱变后木霉某些基因被诱导使其更耐受农药而具有更好的竞争力,甚至有可能成为农药降解菌,而木霉也是目前研究较多的农药降解菌之一[21-22].