斜纹夜蛾核型多角体病毒的鉴定及室内消除

徐莉,李冬植,陈锡岭,张少武,周锋,关祥斌,曹琼,司贤良,李剑峰,刘润强

（1.河南科技学院资源与环境学院,河南新乡453003；2.陕西美邦药业集团股份有限公司,陕西渭南715500；3.河南省植物保护植物检疫站,河南郑州450002；4.河南省农药检定站,河南郑州450002；5.上海沪联生物药业（夏邑）股份有限公司,河南商丘476400；6.河南银田精细化工有限公司,河南原阳453500）

斜纹夜蛾（Spodoptera litura（Fabricius））是一种鳞翅目夜蛾科的农业害虫,广泛分布于世界各地,寄主范围涉及棉花、烟草、大豆以及蔬菜等120 种作物[1],其在幼虫阶段具有暴食性,极易爆发成灾.化学农药仍然是当前防治斜纹夜蛾的主要手段,根据文献报道,在巴基斯坦、印度和中国的多地,斜纹夜蛾已对多种传统型和新型杀虫剂产生了不同程度的抗药性,包括拟除虫菊酯类、有机磷、氨基甲酸酯、双酰胺以及阿维菌素等[2-9].由抗药性导致的防效下降和用药量增加,不仅给作物产量造成了严重影响,对环境安全也产生了极大的威胁.采用室内饲养技术提供斜纹夜蛾标准试虫,对于防治斜纹夜蛾农药品种的筛选、抗药性研究和综合防治,以及种质资源利用,均具有十分重要的意义.

斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus,SlNPV）是一种有效防治斜纹夜蛾的微生物农药,已广泛用于斜纹夜蛾的田间防治,具有害虫不易产生抗药性、对环境和非靶标生物安全、对斜纹夜蛾种群具有较高的致病和致弱作用等特点[10].然而室内饲养的斜纹夜蛾种群一旦感染SlNPV,处理不当即可导致整个实验种群的灭绝,严重影响斜纹夜蛾相关研究工作的顺利进行.

截至目前,对SlNPV 的基因功能和田间应用研究较多[11-16],而如何解决实验室条件下试虫感染SlNPV的问题尚未见报道,本文就实验室饲养的标准试虫感染SlNPV 的鉴定以及防治方法进行研究,以期为实验室斜纹夜蛾标准化饲养提供参考.

1 材料与方法

1.1 试虫饲养及染毒

2019 年8 月和9 月先后从湖北潜江和浙江绍兴采集斜纹夜蛾幼虫100 余头,将其转入养虫室与长期室内饲养的广西种群[17]在室内不接触药剂的情况下连续饲养,饲养条件为27±1 ℃,相对湿度保持在60%～70%,光照周期（光∶暗）14 h∶10 h.其中潜江种群在养虫室饲养一代,各阶段虫态均表现正常.而绍兴种群的幼虫在采集当代即出现腹部淡红色,虫子向高处爬,倒挂于管口棉花处,稍微碰触即导致虫体裂解,流出白色无气味脓状物,死亡时间长则虫体自行腐烂裂解为灰白色液体等症状,幼虫化蛹后出现腹部包裹缺陷（图1）,不能正常羽化和产卵,未能饲养至下一代.当绍兴种群与潜江种群和广西种群混养时,潜江种群和广西种群的幼虫随即出现上述症状,通过文献查阅,初步推断此症状是感染SlNPV 所致.为了解决此问题,保障室内种群实验材料的延续,以潜江种群为研究对象,对该病害进行了鉴定和防治方法的探索.

图1 斜纹夜蛾幼虫和蛹感染SlNPV 的症状Fig 1. The symptoms of S. litura larvae and pupal infected with SlNPV

1.2 病毒粗提

取5 条典型患病死虫于已灭菌研钵中研碎,放置一段时间使其腐化,细胞降解释放出病毒颗粒.用无菌蒸馏水将研磨物冲洗至一小烧杯中,取部分悬液置于离心管中,4 000 r/min 离心30 min,弃上清,用适量的无菌蒸馏水悬浮沉淀,800 r/min 离心5 min,取上清转入另一离心管中,再重复以上离心步骤两次,得到纯化的病毒颗粒.

1.3 病毒的分离鉴定

根据文献报道合成两对以SlNPV 的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶（Ecdysteroid UDPglucosyltransferase,egt）为模板的特异性引物egt-F1：5 "-GCCTCGTCGGTCGACTGGAC-3 ", egt -R1：5"-TTCGATAACAATCGGCCTGTACC-3",产物大小380 bp[18]；egt-F2：5"-GCCAAAGATTCATAACCATAG TCGTCATA-3",egt-R2：5"-TTCGGCGTAGGCGGTTGTTTCGTCA-3",产物大小685 bp[19].以1.2 中分离纯化的病毒颗粒为模板,分别以egt-F1、egt-R1 和egt-F2、egt-R2 为引物对,使用2×Taq MasterMix（北京天根）进行扩增,用普通琼脂糖DNA 回收试剂盒（北京天根）回收扩增产物,送上海生工测序.

1.4 SlNPV 的室内消除

以已感染病毒的潜江种群为研究对象,分别按照表1 的两种方法进行饲养,用调整前的饲养方案进行一代试验,调整后的饲养方案连续进行两代试验,统计幼虫化蛹率和蛹的羽化率.

表1 斜纹夜蛾各虫态调整前后的饲养方案对比Tab.1 The rearing methods comparison of S.litura before and after adjustment

2 结果与分析

2.1 SlNPV 鉴定结果

以粗提取的病毒颗粒为模板,以egt-F1、egt-R1 和egt-F2、egt-R2 为引物对,PCR 扩增结果如图2 所示, 均能得到与预期大小一致且特异性好的条带, 将扩增条带的测序结果与egt（GenBank 登录号：X99073.1）的DNA 序列进行比对,显示引物对egt-F1 和egt-R1 的扩增结果与该基因序列有100%的同源性（见图3）,引物对egt-F2 和egt-R2 的扩增结果与该基因序列只有一个碱基差异（见图4）,证明斜纹夜蛾感染的病毒即为SlNPV.

图2 病毒粗提物egt 基因的PCR 结果Fig.2 The PCR results of egt from virus extracts

图3 引物对egt-F1 和egt-R1 的扩增序列与SlNPV egt 基因的同源性比对Fig.3 The blast result of the PCR result of egt-F1 and egt-R1 and SlNPV egt

图4 引物对egt-F2 和egt-R2 的扩增序列与SlNPV egt 基因的同源性比对Fig.4 The blast result of the PCR result of egt-F2 and egt-R2 and SlNPV egt

2.2 饲养方案调整前后SlNPV 的室内消除效果

染病幼虫饲养方案调整前及调整后两代的种群生长情况见表2.

表2 染病斜纹夜蛾幼虫饲养方案调整前及调整后两代的种群繁殖情况Tab.2 The reproduction of S. litura larvae infected with SlNPV before and after rearing method adjustment

由表2 可知,饲养方案调整前有81.3%（488 头）的斜纹夜蛾幼虫感染SlNPV,且多在5～6 龄出现感病症状.虽然有18.67%（112 头）的幼虫可以化蛹,但大部分虫蛹存在腹部包裹不全的缺陷（图1）,这类虫蛹不能正常羽化,最终只有4.83%（29 头）的正常虫蛹,且羽化率只有68.97%.饲养方案调整后的第一代试虫,虫蛹数即得到明显提高,正常虫蛹数达到125 头,化蛹率62.50%,与调整前有明显的提升,羽化率也提高到96.00%.采用调整后的饲养方案继续饲养第一代染病幼虫的后代,即第二代斜纹夜蛾幼虫,幼虫的化蛹率和羽化率得到进一步提高,分别达到90.00%和97.78%,饲养方案调整后,指行管中饲养的试虫很少出现染病症状.

3 结论与讨论

SlNPV 虽然对田间斜纹夜蛾种群有致病和致弱作用,但其在自然条件下效果不稳定[20],一般需要与其他杀虫剂复配使用,以达到良好的杀虫效果.然而在饲养斜纹夜蛾的实验室,由于环境封闭且温湿度适宜,SlNPV 极易流行并形成持续性的交叉感染,使病毒迅速在多个种群中传播,严重威胁斜纹夜蛾标准试虫的饲养,探索一套控制SlNPV 在室内流行的方法对斜纹夜蛾相关科学研究有重要意义.

随着SlNPV 作为生物农药的广泛使用,田间斜纹夜蛾感染SlNPV 存在一定的普遍性.本研究中从绍兴采集的斜纹夜蛾种群中携带SlNPV,并传染至健康种群,包括在室内饲养多代的广西种群和在室内饲养一代的潜江种群.温荣辉等[18]对采自广西16 个地区的200 份自然死亡斜纹夜蛾样本进行检测,发现其中6 个地区的62 份样本中可以检测到SlNPV,表明广西田间的斜纹夜蛾自然种群中已经存在SlNPV 的流行.因此建议田间采集的斜纹夜蛾幼虫带回实验室后应先放在培养箱等隔离空间内单独饲养,饲养一代无病毒感染症状后再转入养虫室饲养,以防止感染室内斜纹夜蛾种群.

NPV 有多种检测方法,包括光学显微镜、DNA 点杂交和PCR 等,PCR 具有灵敏度高、方便快捷的特点, 但是对引物特异性要求高.egt 是SlNPV 中的一个保守基因, 在多种NPV 病毒中均存在,egt-F2 和egt-R2 特异性好,只有当模板是SlNPV 时才能扩增出目的条带[19],使用两对特异性引物同时进行扩增,更保证了试验结果的准确性.我们的试验进一步证明了引物对egt-F2 和egt-R2 的特异性,可以作为PCR法鉴定SlNPV 的特异性引物.

病毒在虫体内的传播方式包括水平传播和垂直传播,垂直传播包括卵内和卵表传播[20],但目前尚未明确SlNPV 是通过卵表或者卵内进行垂直传播.本研究通过对子代卵块和蛹的消毒,以及初孵幼虫的分装,在室内环境下除了个别虫体仍被感染外,基本可以消除SlNPV 在斜纹夜蛾种群中的传播.但是如果只对卵块和蛹消毒,仍将幼虫放于塑料方盒集中饲养（该法饲养方便、效率高）,通过进食和排泄导致水平传播,幼虫在生长后期则会有较多个体感染病毒.因此,我们的试验可以表明SlNPV 主要通过卵表传播,同时仍有较低概率的卵内传播.张彦[21]对家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV）的传播方式进行研究,发现只需雌蛾或雄蛾染毒,子代幼虫就会出现染毒症状,即使对染毒虫卵严格消毒后,仍然可以用PCR 检测到BmNPV 的存在,表明BmNPV 在家蚕的垂直传播中也包括卵表和卵内两种传播方式. 蒋杰贤等[22]用甜菜夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera exigua Nucleopolyhedrovirus,SeNPV）感染4 龄和5 龄甜菜夜蛾幼虫,研究对子代的影响,发现母体经口感染后可导致子代20%～48%的死亡,即使对卵表消毒,依然可导致子代18.8%的死亡率,也证明了SeNPV 存在卵内和卵表传播途径.综合考虑SlNPV 的传播规律,制定斜纹夜蛾核型多角体病毒的室内消除方案,既要通过表面消毒阻断垂直传播中的卵表传播,又要严格按照单管分装饲养阻断小概率的卵内传播引起的水平交叉感染.