BMP15 对绵羊卵丘细胞扩展相关基因及激素受体基因表达量的影响

赵 茜，努日比娅姆·麦麦提托合提，张 博，阿尔曼·海热，宋玉坤，阿布力孜·吾斯曼*

（1.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.成都西囡妇科医院，四川成都 610023）

卵丘细胞是包裹在卵母细胞周围的颗粒细胞群，它与卵母细胞构成卵丘-卵母细胞复合体（COCs）并通过间隙连接调节卵母细胞的发育与成熟[1]。与其他哺乳动物一样，卵泡刺激素（FSH）、促黄体素（LH）等激素调控绵羊卵泡的发育[2]，而激素的作用则依赖于相应受体的表达。同时，卵丘细胞扩展依靠相关基因的参与，以保证卵丘完整、卵丘扩展及卵母细胞成熟的完成。

骨形态发生蛋白15（BMP15）属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族中的一员，是卵泡发育的关键调节因子，在卵泡发育中以自分泌和/或旁分泌因子的作用影响卵母细胞发育及成熟。有研究表明，BMP15 促进牛颗粒细胞FSH 受体表达及调控其激素分泌[3]，并且抑制卵丘细胞的凋亡[4]，调控颗粒细胞的增殖和分化。卵泡发育过程中，除机体内分泌系统调控外，通过颗粒细胞和卵丘细胞介导的卵母细胞自分泌、旁分泌因子同样维持卵泡发育内环境稳态，调节卵母细胞成熟[5]。卵母细胞分泌的BMP15 和生长分化因子9（GDF9）参与卵母细胞与卵丘细胞/颗粒细胞的双向信息交流[6]，且BMP15 在卵母细胞中特异性表达[7]。

在绵羊卵泡发育中，BMP15 的作用机理研究较少，本实验以绵羊卵丘细胞为研究对象，利用荧光定量PCR法测定在绵羊卵丘细胞体外培养环境中添加不同浓度BMP15 对卵丘细胞扩展相关基因及激素受体基因表达量的影响，探索BMP15 对绵羊卵丘细胞调控卵泡发育的影响，为优化卵母细胞体外成熟培养条件提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 绵羊卵巢采自新疆乌鲁木齐市新华凌某牛羊屠宰场。BMP15（R&D）、DMEM/F12、胰蛋白酶和胎牛血清FBS 购自Gbico 公司，透明质酸酶和肝素钠购于Solarbio 公司，细胞RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自TaKaRa 公司，磷酸缓冲盐溶液PBS 购自上海生工，其余药品均购自美国Sigma 公司。

1.2 试剂配制 采卵液：准确称取9.5 g TCM199，4 g BSA，2.383 g HEPES，0.4 g NaHCO3，6.86 g HEPESNa+，青霉素、链霉素各0.1 g 放入灭菌去离子水中溶解，加入30 mL 2 500 U/L 肝素钠溶液，灭菌去离子水定容至1 000 mL，4℃保存备用。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank 数据库中公布的绵羊β-actin、FSHR、LHR、E2R、HAS2、PTGS2、PTX3基因序列设计荧光定量引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 Real-time PCR 引物信息

1.4 实验方法

1.4.1 卵巢收集 从屠宰场采集健康绵羊卵巢，放入35～37℃含有0.1% 青霉素和链霉素的生理盐水的保温瓶中，于2 h 内运回实验室。选择形态正常、无黄体的健康卵巢用眼科手术剪剪去卵巢表面系膜等结缔组织并于生理盐水中反复清洗。

1.4.2 卵母细胞采集 本实验采用割卵法进行卵母细胞的收集。用镊子固定卵巢，选择直径3～8 mm 的卵泡用手术刀片割破，使卵泡液流入放有采卵液的培养皿中，置于恒温板上。

1.4.3 卵丘细胞收集及培养 在体视镜下用捡卵针挑选胞质均匀、包裹有三层以上卵丘细胞的COCs，放入0.1%透明质酸酶中使用移液枪反复吹打直至卵丘细胞与卵母细胞完全分离，体视显微镜下洗出裸卵。将含有卵丘细胞的混合液收集于1.5 mL 离心管中，加入HEPES缓冲液至1 mL，2 000 r/min 离心5 min，洗涤2 次后用DMEM/F12 培养液离心洗涤1 次。将分离得到的绵羊卵丘细胞重悬于含有10% 的FBS 及0.1% 双抗的DMEM/F12 培养液中37℃、5% CO2完全湿度培养，待细胞铺满80%时传代。

1.4.4 卵丘细胞消化传代 弃去旧培养基，用1 mL PBS清洗2 次，加入1 mL 0.25% 胰酶轻微晃动培养瓶，将消化液分布至所有细胞表面，放于37℃、5% CO2培养箱中消化2 min。镜下观察细胞间隙增大时加入2 mL 完全培养液终止消化。用移液枪轻轻吹打使细胞脱离并将混合液放入1.5 mL 离心管中2 000 r/min 离心5 min，收集卵丘细胞，加入完全培养基吹打成细胞悬液，计数并调整细胞数为1×105个/mL，重新接种于培养皿中，待培养皿中细胞铺满80% 时分别加入含有不同浓度BMP15（0、25、50、100、200 ng/mL）的低血清（5%FBS）培养液，以0 ng/mL 组为对照，37℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h。

1.4.5 细胞RNA 提取 按照TaKaRa miniBEST Universal RNA Extraction kit 提取试剂盒步骤进行RNA 提取，并用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定细胞总RNA 完整性，分光光度计测定总RNA 的浓度和纯度（D260/D280=1.8～2.0）。

1.4.6 cDNA 文库建立 每管按如下体系反转录：5×RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 5 μL，总RNA1～3 μL，RNase Free dH2O补足至总体积10 μL；在PCR 仪上37℃ 15 min，85℃ 5 s；-20℃保存。

1.4.7 荧光定量PCR 根据PrimeScript™RT reagent kit（Tli RNaseH Plus）试剂盒，建立25 μL 反应体系：荧光染料12.5 μL（终浓度1×），上下游引物各1 μL（终浓度0.4 μmol/mL），cDNA 溶液2 μL（终浓度100 ng/mL），ddH2O 补足体系。目的基因mRNA 水平的表达量变化，以β-actin作为内参基因，每样品cDNA 重复3 次。

反应条件为：预变性95℃，30 s；变性95℃，5 s，退火53℃，30 s；共37 个循环；信号采集72℃，1 min终止反应。

1.4.8 统计分析 采用2-△△Ct法计算各基因在BMP15作用后的表达量变化。应用SPSS19.0 软件中One-way ANOVA 以及Duncan's 法进行多重比较对各组处理之间基因表达量进行差异性分析，P＜0.05 作为差异显著的标准，P＜0.01 作为差异极显著的标准。

2 结果

2.1 卵丘细胞总RNA 提取结果 用试剂盒提取培养卵丘细胞中总RNA，分光光度计测定总RNA 浓度与纯度（D260/D280=1.8～2.0），结果符合要求。经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，总RNA 有28 s 和18 s 2条带，表明提取的总RNA 无降解，可以用于后续实验。

图1 卵丘细胞总RNA 凝胶电泳图

2.2PTX3、FSHR、LHR、E2R、HAS2、PTGS2和β-actin熔解曲线分析 由图2 可知，目的基因和内参基因引物工作状态良好，产物峰单一，无非特异性扩增。

图2 基因熔解曲线图

2.3 BMP15 对绵羊卵丘颗粒细胞扩展相关基因mRNA表达量的影响 如图3 所示，添加50 ng/mL BMP15时HAS2基因表达量显著高于对照组；添加100 ng/mL BMP15 时HAS2与PTGS2基因表达量极显著高于对照组及其他浓度处理组，添加100 ng/mL BMP15 时PTX3基因表达量极显著高于对照组与其他处理组（除50 ng/mL处理组）。

2.4 BMP15 对绵羊卵丘颗粒细胞激素受体基因mRNA表达量的影响 由图4 可知，添加100 ng/mL BMP15时，FSHR表达量极显著高于对照组及其他处理组，LHR表达量显著性高于25、200 ng/mL 浓度组；添加100 ng/mL BMP15 时E2R表达量显著高于对照组、50、200 ng/mL 处理组，极显著高于25 ng/mL 处理组。

3 讨 论

卵丘细胞扩展是卵母细胞成熟的标志之一，卵丘细胞中PTGS2、HAS2和PTX3是卵丘细胞扩展的相关基因，在LH、FSH 和E2参与下共同完成卵丘细胞的扩展[8]。在卵丘细胞扩展过程中，PTGS2基因主要诱导LH、FSH 等激素与其相应的受体结合[9]，HAS2基因催化透明质酸的合成[10]，PTX3基因是排卵相关基因，敲除小鼠的PTX3基因可以导致小鼠排卵失败[11]。本研究结果表明，随着BMP15 浓度的增加，绵羊卵丘细 胞PTGS2、HAS2和PTX3基因以及FSHR、LHR和E2R的表达量增加，并在100 ng/mL 时表达量达到峰值，浓度进一步增加时表达量降低，说明绵羊卵丘细胞基因表达与BMP15 浓度呈不完全依赖关系。有研究表明BMP15 可增强小鼠和牛的卵丘扩展[12-14]。翟博[15]添加BMP15 处理培养猪卵丘细胞，利用流式细胞检测技术发现100 ng/mL 添加量可以有效抑制猪卵丘细胞凋亡；Machado 等[16]研究发现在牛COCs 体外成熟培养液中添加BMP15 可增加PTGS2和PTX3mRNA 水平，这与本研究结果相似，说明在体外培养卵丘细胞中添加BMP15 可影响PTGS2、HAS2和PTX3基因的表达，可通过添加BMP15 上调卵丘细胞中PTGS2、HAS2和PTX3基因的表达水平来促进卵丘细胞扩展，进而提高绵羊卵母细胞发育质量。

FSH、LH 是卵泡发育主要的调控者[17-18]，FSHR、LHR的获得对颗粒细胞分化和卵泡成熟是必需的[19]。FSH 刺激未成熟的有腔卵泡，上调促黄体激素受体的表达水平，并且可促进卵巢分泌少量E2[20]，E2加强FSH 刺激颗粒细胞表达LHR。付瑶等[3]研究发现添加100 ng/mL BMP15 可以促进牛颗粒细胞FSHR基因表达，这与本研究结果一致。Ken Shimizu 等[21]在人颗粒细胞培养液中添加BMP15 时发现，FSHR基因表达量随着BMP15浓度的增加而升高，呈剂量依赖关系，这与本研究结果不一致，可能由于人和绵羊卵丘细胞对于BMP15 敏感性不同而导致。

图3 HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA 相对表达量

图4 FSHR、E2R、LHR mRNA 相对表达量

4 结 论

本实验条件下，添加BMP15 可以提高体外培养卵丘细胞扩展相关基因HAS2、PTGS2、PTX3基因和激素受体FSHR、E2R、LHR基因的表达，并且在100 ng/mL浓度时表达量最高，但随着BMP15 浓度增加，各基因表达量开始下降。推测添加BMP15 不仅能够促进绵羊卵丘细胞FSHR、E2R、LHR的表达，还能够调节其激素分泌。