非小细胞肺癌中KiSS-1、MMP-2和MVD的表达及意义

赵天源，常延河，张艳敏，夏彦东

肺癌是对人类威胁极大的恶性肿瘤，其发病率和病死率位居全球前列[1]，肿瘤转移是造成患者预后不良的主要原因，其是由多基因、多步骤共同参与的过程。本实验旨在探讨肿瘤转移抑制基因亲吻素-1(kisspeptin 1, KiSS-1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和微血管密度(microvessel density, MVD)(采用CD34标记肿瘤血管而测定)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表达及与预后关系，寻找一种可靠的能早期预测肺癌转移和判断预后的指标，以期为临床提供有效的诊断预测指标和新的治疗干预靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2008年1月～2013年5月河北省唐山市开滦总医院诊治的97例NSCLC患者，患者均经手术、支气管镜等病理诊断确诊，临床资料完整，术前均未行放、化疗及免疫治疗；其中男性74例，女性23例；年龄42～80岁，中位年龄61岁；鳞癌53例，腺癌44例；无淋巴结转移者32例，有淋巴结转移者65例；肿瘤临床分期采用国际抗癌协会1997年公布的NSCLC TNM分期标准：Ⅰ期18例，Ⅱ期33例，Ⅲ期30例，Ⅳ期16例。另选取同时期就诊的20例肺良性病变患者作为对照组。NSCLC组和对照组均禁食10～20 h，于术前1天清晨及术后第10天清晨抽取肘静脉血3 mL，3 000 r/min离心10 min，分离新鲜血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂 兔抗人单克隆抗体KiSS-1、MMP-2、CD34及ELISA试剂盒，均购自武汉博士德公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法 采用ELISA法检测97例NSCLC和20例肺良性病变患者血清中MMP-2的水平并严格按试剂盒说明书进行操作，加稀释液于96孔板中，加样，孵育2 h，缓冲液清洗，加MMP-2结合物，加底物，加终止液。检测结果用酶标仪测定。

1.3.2 免疫组化 将97例NSCLC和20例肺良性病变患者手术切除标本石蜡包埋，常规脱蜡、水化，3%双氧水，微波抗原修复，10%正常羊血清封闭；分别滴加1 ∶200的KiSS-1、MMP-2和CD34抗体，4 ℃过夜，滴加辣根过氧化酶标记兔抗人IgG，37 ℃孵育1 h，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。用PBS代替一抗作为阴性对照，取阳性对照片作为阳性对照。

1.4 判断标准 KiSS-1和MMP-2判定标准：KiSS-1胞质呈棕黄色为阳性；MMP-2胞膜或胞质呈棕黄色为阳性；采用阳性细胞百分比和着色强度进行综合判断。(1)按阳性细胞百分比计分：≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分；(2)按细胞染色强度计分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分结果相加：<3分为阴性，≥3分为阳性。

CD34阳性为血管内皮细胞胞质呈浅棕色至深棕色。MVD计数标准(采用Weidner计数标准)：先在显微镜低倍视野下找到3个微血管密集区，然后在高倍视野下计数CD34阳性的微血管数。同一张切片计数3个高倍视野，其结果取3次平均值。所有切片均采用双盲法阅片。

2 结果

2.1 NSCLC中KiSS-1、MMP-2和MVD的表达 KiSS-1在对照组中均呈阳性，在NSCLC组中的阳性率为49.48%(48/97)。KiSS-1在NSCLC的Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移组中的表达与Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型和分化程度无关。

最终建立了去皮减毒工艺相关系数模型的具体参数为：6张典型雷公藤去皮净制完全的打粉样本NIR光谱，取其平均作为参比光谱（take average as reference）；数据预处理方法（data preprocessing）二阶导数，平滑点数设置为9；光谱范围5800 cm-1～5500 cm-1，4400 cm-1～4200 cm-1；不排除 CO2区域；平均相关系数 （average threshold）＞90%认为净制完全，去皮减毒工艺水平较好。

MMP-2在对照组中呈阴性，在NSCLC组中的阳性率为52.58%(51/97)。MMP-2在肿瘤直径>3 cm、腺癌组、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移组中的表达与肿瘤直径≤3 cm、鳞癌组、Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；与患者性别、年龄、肺癌分化程度无关(P>0.05)。

CD34高表达于血管内皮细胞，周围组织不着色。CD34标记的血管数：20例对照组中微血管数为(24.90±10.46)条，实际范围5～41条；97例NSCLC组中微血管数为(59.20±18.23)条，实际范围19～109条。NSCLC组与对照组之间的MVD差异有显著性(t=-11.500，P<0.01)，MVD在Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移组数量高于Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移组；与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型和分化程度无关(表1，图1～6)。

2.2 NSCLC中血清MMP-2的表达 NSCLC术前组血清MMP-2表达水平[(530.83±57.21)ng/mL]显著高于NSCLC术后组[(260.25±23.20)ng/mL]和对照组[(242.16±30.43)ng/mL](P<0.05)。NSCLC术后组血清MMP-2表达与对照组相比，差异无显著性(P>0.05)。

MMP-2在肿瘤直径>3 cm、肺腺癌组、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移组中的表达与肿瘤直径≤3 cm、肺鳞癌组、Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移组相比，差异有显著性(P<0.05)。MMP-2表达与患者性别、年龄、分化程度无关(P>0.05，表2)。

2.3 NSCLC中血清MMP-2水平与组织MMP-2蛋白表达的相关性 NSCLC组织中MMP-2蛋白阳性者，其血清MMP-2水平高于MMP-2蛋白阴性者(P<0.05，表3)。

2.4 NSCLC组织中KiSS-1、MMP-2、MVD表达和术后生存率的关系 根据免疫组化表达结果将NSCLC组分为KiSS-1阴性组和KiSS-1阳性组，Kaplan-Meier生存曲线提示：KiSS-1阳性者术后5年生存率(9.28%)显著高于阴性者(1.03%)(P<0.01)。

根据免疫组化结果将NSCLC组分为MMP-2阴性组和MMP-2阳性组，Kaplan-Meier生存曲线提示：MMP-2阳性者术后5年生存率(2.06%)显著低于阴性者(8.25%)(P<0.01)。

①②③④⑤⑥

图1 KiSS-1在肺鳞癌组织中呈阳性，SP法 图2 KiSS-1在肺腺癌组织中呈阳性，SP法 图3 MMP-2在肺鳞癌组织中呈阳性，SP法 图4 MMP-2在肺腺癌组织中呈阳性，SP法 图5 CD34在肺鳞癌组织中呈阳性，SP法 图6 CD34在肺腺癌组织中呈阳性，SP法

图7 KiSS-1(A)、MMP-2(B)和MVD(C)的表达水平与非小细胞肺癌患者5年生存率的关系

表2 术前血清MMP-2水平与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

表3 非小细胞肺癌组织和血清中MMP-2表达的相关性

3 讨论

肿瘤转移是肿瘤细胞与宿主细胞之间多种分子和基因相互作用的结果，是多步骤参与的过程；其中突破基膜是转移的首要环节。MMP-2作为基质金属蛋白酶家族中的重要成员之一，能够特异性的降解基膜和结缔组织等细胞外间质(Ⅳ型胶原和层黏蛋白)[2]，从而降低细胞之间的黏附作用，促进肿瘤细胞的迁移。焦娟等[3]研究表明，三阴型乳腺癌对MMP-2通路进行活化，从而达到促进肿瘤浸润转移的目的。以往的实验标本通常为一种组织，而本实验采用免疫组化法和ELISA法同时对癌组织和血清中MMP-2的水平进行测定，并获得一致性结果：NSCLC患者术前MMP-2的表达水平显著高于肺良性病变患者和术后的表达水平(P<0.05)；MMP-2表达与肿瘤大小、病理类型、TNM分期、淋巴结有无转移密切相关。这与Ali等[4]把血清MMP-2水平作为评价肿瘤恶性程度的有效指标观点相符。本实验采用两种方法联合检测提高了实验结论的准确性及可信度，且外周血取材简便易行，更易推广应用。

表4 KiSS-1、MMP-2、MVD表达与非小细胞肺癌患者5年生存率的关系

闫铁夫等[5]的研究结果表明，肿瘤细胞的浸润和转移需要大量新生血管的形成。CD34是与新生血管内皮细胞增殖有关的蛋白，常作为肿瘤MVD的标志物，目前已将MVD作为评估肿瘤血管形成的重要标准[6]。本实验采用免疫组化法计数20例对照组肺组织和97例NSCLC患者的微血管数量，结果显示：NSCLC组与对照组之间的MVD差异有显著性(P<0.01)，且MVD与肿瘤TNM分期和淋巴结有无转移相关(P<0.01)。进一步分析与5年生存率的关系，结果显示：微血管数高组肺癌患者术后5年生存率(4.12%)显著低于低组(6.19%)(P<0.01)。上述结果提示微血管计数有助于判断患者的预后情况，与唐智等[7]认为微血管数可以用来评估鼻腔(窦)鳞状细胞癌预后的结论相符。

王洪兴等[8-9]的研究结果表明KiSS-1对胃癌细胞株的侵袭和转移有明显抑制作用。Wang等[10]研究发现分化良好、肿瘤体积小、无淋巴结转移的胆囊癌KiSS-1的表达显著高于分化差、肿瘤体积大、并伴浸润和转移的胆囊癌。KiSS-1在肺癌中的表达，尤其是与患者术后生存期的关系，国内外较少报道。本实验结果显示：KiSS-1表达与NSCLC临床TNM分期、淋巴结有无转移有关(P<0.05)。对NSCLC患者进行5年生存期分析发现，KiSS-1阳性者术后5年生存率(9.28%)显著高于阴性者(1.03%)(P<0.01)。

综上所述，KiSS-1、MMP-2和MVD与NSCLC的转移和预后密切相关，三者可作为肿瘤恶性程度的评判指标和基因治疗的靶点，并对患者生存期的预测提供一定的帮助。