CNP、12/15-LOX基因多态性与早发冠心病关系的研究

路艳 郭纪文 徐晓辉 卫艳宁 朱彤 王琴丽

(西电集团医院心内科，陕西 西安 710000)

冠心病(coronary artery disease，CAD)是全球主要致死、致残疾病之一，严重威胁人类健康和患者生存质量[1]。随着CAD发病年龄的日渐年轻化，人们又提出早发冠心病(premature coronary artery disease，PCAD)的概念，即CAD发生时男性≤55 岁，女性≤65 岁。遗传学规律表明，疾病发生越早，与遗传学关系越密切。CNP通过与细胞表面NPR-B及 NPR-C结合，分别激活GC-cGMP-PKGI通路、Gi-AC-cAMP-PLC通路以及MAPK级联通路等发挥多种心血管生物调节功能[2-4]。CNP具有调节血管张力，抑制血小板、白细胞相互作用及活化，调节内皮、血管平滑肌增殖，抑制心肌细胞肥大等功能，进而参与动脉粥样硬化、主动脉瓣钙化、心室重构、支架内再狭窄以及缺血—再灌注损伤等多种心血管病理生理过程的调节[5-8]。12/15-LOX能够参与到机体炎性反应的过程中，而冠心病患者冠状动脉粥样硬化的发生，同样与血管内皮损伤及炎性反应有关[9-13]。本研究采用MALDI-TOF法，通过对CNP基因位点rs5262、12/15-LOX基因位点rs916055的单核酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的研究，进一步探讨了CNP、12/15-LOX 基因多态性与PCAD遗传易感性的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象 选择2017年4月至2018年4月我院心内科住院PCAD患者58例(男≤55岁，女≤65岁)作为实验组，患者均符合冠心病诊断标准：经冠状动脉造影证实至少1支主要冠状动脉狭窄≥50%。入选62例非冠心病者作为对照组，经冠状动脉造影排除CAD。排除标准：心肌病、先天性心脏病、严重肝脏和肾脏疾病。两组患者年龄、性别等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要仪器及试剂 iPLEX试剂盒；质谱检测仪器；SpectroCHIP芯片；引物合成；DNA提取试剂盒等。

1.3研究方法 采晨空腹静脉血4～5 mL，行相关实验室指标检测，余血EDTA抗凝，-80℃保存，用于后续SNP位点基因型鉴定。按DNA提取试剂盒操作步骤并检测OD值(A260/A280)，A260/A280>1.8，则DNA纯度合格。

1.4PCR-MALDI-TOF法检测rs5262、rs916055位点的SNPs 使用MassARRAY Assay Design软件和Sequenom公司Genotyping Tools对rs5262和rs2728121两位点PCR扩增引物及单碱基延伸引物进行设计，引物详细信息见表1。PCR扩增：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃变性20 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，进行45个循环；最终72 ℃延伸3 min，4 ℃。PCR产物纯化：采用两种方式对温度与时间进行了控制，当温度为37 ℃时，应将纯化的时间控制在20 min。随着温度的上升，纯化时间可逐渐缩短。当温度达到85 ℃时，仅纯化5 min便可达到满意的效果。单碱基延伸反应：首先将温度设置为了94 ℃，该温度下，反应30 s便可达到实验所需要的效果。随后，本研究在温度不变的情况下，将反应时设置为了5 s，进一步对反应效果进行了观察。质谱检测：纯化后置入在384孔SpectroCHIP芯片上，进行上机测定，使用MALDI-TOF技术对SpectroCHIP芯片进行分型检测，结果使用Sequenom TYPER 4.0软件分析。

表1 SNP分型引物序列

1.5统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1一般临床资料比较 实验组男/女、年龄、胆固醇、低密度脂蛋白、体重指数、糖尿病与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，实验组吸烟史、高血压史、CAD家族史与对照组对比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 一般临床资料的比较

2.2rs5262、rs916055位点基因型与等位基因在两组的分布 rs5262位点、rs916055位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。实验组与对照组rs5262位点存在A/A、A/G、G/G的三种基因型，差异有统计学意义(P<0.001)。我们推测，rs5262等位基因与PCAD发病无相关性。两组rs916055位点基因型差异显著(P<0.001)，实验组A等位基因携带率高于对照组(P<0.05)；与对照组相比，实验组组AA+AG基因型频率较高，我们认为，rs916055 中A等位基因，与疾病的发生存在一定的关系，见表3。为了排除吸烟史，高血压病史和CAD家族史对多态位点与PCAD相关性之间相关性的影响，我们在调整了上述危险因素后，进一步进行了二项Logistic回归分析，见表4。rs916055 位点A等位基因的OR(95%CI)为3.622(2.140～6.128，P<0.001)。

表3 rs5262、rs916055的基因型与等位基因频率在实验组和对照组的分布

2.3rs5262、rs916055位点PCR扩增产物质谱分析结果 见图1～2。

表4 rs5262 G、rs916055 A等位基因与实验组的Logistic回归分析

图1 rs5262 图2 rs916055

3 讨 论

CAD是一种威胁当今人类健康的常见疾病，目前被认为是由包括遗传因素在内的复杂多因素疾病。随着近年来CAD发病年青化倾向，提出了PCAD的概念。基因多态性是指在某个基因座上≥2个不同等位基因，基因的多态性逐渐成为了近年来冠心病危险因素研究的新领域。CNP是利钠肽家族成员，由VEC合成，以自分泌和旁分泌的形式发挥调节局部血管张力，抑制血小板、白细胞活化，调节VEC、VSMC增殖，抑制心肌细胞肥大以及拮抗ET-1作用等多种生物学活性。推测其可能在动脉粥样硬化、心室重构、支架内再狭窄以及缺血-再灌注损伤等多种心血管病理生理过程发挥重要作用[14-16]。12/15-LOX属于脂氧合酶家族，有充分证据表明12/15-LOX参与动脉粥样硬化的发展。12/15-LOX通过炎症反应参与动脉粥样硬化的发展，国内外学者[9-13]已探索了12/15-LOX基因多态性与颈动脉粥样硬化斑块的关系，其结论并不完全一致。

本研究发现，实验组与对照组rs5262位点存在A/A、A/G、G/G差异显著(P<0.001)，表明三者与冠心病的发生之间，存在显著的相关性，临床应对该问题加以重视。从以上结果我们同样可以推测，rs5262等位基因与PCAD发病无相关性。进一步观察发现，两组A基因型频率相比差异具有统计学意义(P<0.001)，实验组A基因型频率较高为82.76%。通过对上述数据的观察可以发现，rs916055 中A等位基因的存在，与PCAD的发生有关。临床可通过检测该基因，实现对冠心病发病风险的评估，并以之为基础，对早发冠心病发病的地域性差异进行分析，为临床对疾病的控制提供参考。

众所周知，吸烟、高血压和CAD遗传史是PCAD发病的独立危险因素。为了排除混杂因素对结果的影响，使用Logistic回归分析来调整吸烟、高血压和CAD遗传史，调整后rs916055等位基因A仍是PCAD的危险因素(P<0.001)，即A等位基因PCAD的风险相对较高。该研究证实rs916055具有遗传预测作为PCAD风险因素的潜力。

综上所述，12/15-LOX基因位点rs916055的SNPs与陕西汉族人群PCAD的遗传易感性有关，为预防和筛查PCAD提供了理论依据。