牛疱疹病毒糖蛋白D的结构特点及在疫苗学中的应用

李志祥 翟璐 宋佰芬

摘 要：牛疱疹病毒1型（Bovine Herpesviruses 1，BHV-1）和牛疱疹病毒5型（Bovine Herpesviruses，BHV-5）是引起牛呼吸道疾病的2大重要病原，其膜糖蛋白D（Glycoprotein D，gD）是病毒粒子的重要组成成分，在疱疹病毒的发病机理方面发挥重要作用。该文介绍了BoHV-1、BoHV-5的结构和功能特征，以及它在病毒进入宿主细胞和与宿主细胞受体相互作用中的作用，讨论了gD与宿主免疫系统的相互作用，并结合该蛋白的结构和功能特点，阐述了其在新疫苗设计中的应用。

关键词：疱疹病毒;gD糖蛋白;结构特点;应用

中图分类号 S855.3 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）07-0016-07

Abstract： The viral envelope glycoprotein D from bovine herpesviruses 1 and 5 BoHV-1 and-5）， two important pathogens of cattle， is a major component of the virion and plays a critical role in the pathogenesis of herpesviruses. Glycoprotein D is essential for virus penetration into permissive cells and thus is a major target for virus neutralizing antibodies during infection. This review highlights the structural and functional characteristics of BoHV-1， BoHV-5 and where appropriate， Human herpesvirus gD， as well as its role in viral entry and interactions with host cell receptors. Furthermore， the interactions of gD with the host immune system are discussed. Finally， the application of this glycoprotein in new vaccine design is reviewed， taking its structural and functional characteristics into consideration.

Key words： Herpesviruses; Envelope glycoprotein D; Structural Characteristics; Applications

皰疹病毒是一类具有包膜、多样的病毒家族，分为α、β和γ3个亚科。α疱疹病毒亚科具有几个共同的特征，包括快速的繁殖周期，具有入侵神经元的能力和在感觉神经节中建立潜伏性感染的特性[1]。该家族还包括人类疱疹病毒，如人类疱疹病毒（HHV）1型和2型，以及动物疱疹病毒。感染反刍动物的α疱疹病毒以牛疱疹病毒1型（BoHV-1）较为常见，而牛疱疹病毒5型（BoHV-5）在兽医学中也具有重要意义[2]。

BoHV-1是引起牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）和传染性脓疱外阴阴道炎（infectious pustular vulvovaginitis， IPV）的病原体，也是牛呼吸系统疾病复合体（bovine respiratory disease complex，BRD）的病原之一，给养牛业带来巨大的经济损失。BoHV-1感染可导致呼吸道严重损伤，为继发性细菌感染创造了机会[3-4]。BoHV-5感染途径和BoHV-1相同，即通过鼻黏膜，眼睛，口咽和生殖道黏膜感染而发生。病毒首先在入侵的上皮细胞中进行增殖，然后扩散到神经元等部位[5]。虽然BoHV-5和BoHV-1在遗传和抗原特性上有很大的关联性，氨基酸序列也有82%的同源性[6]，但它们在入侵神经和神经毒性方面的特性不同。BoHV-1的神经侵犯通常不会超过三叉神经节的一级神经元，并在神经元位置建立潜伏性感染，而BoHV-5则可以感染大脑的不同区域，尤其在青壮年动物中引起致命的脑炎[7]。

疫苗接种是预防和控制这些病毒性疾病最有效的方式之一。现有的BoHV-1减毒活疫苗和灭活疫苗虽有一定效果，但在安全性和有效性方面仍存在缺陷，该疫苗不适合接种一些特定的动物，如怀孕的奶牛[8]。BoHV-1和BoHV-5疫苗开发的新战略主要集中在标记疫苗（也被称为DIVA疫苗），以此来区分受感染动物和已接种动物。DIVA疫苗包括基因工程缺失病毒（如gE缺失病毒）以及基于病毒包膜糖蛋白如gD的亚单位疫苗或载体疫苗。BoHV-1gE缺失标记活疫苗已经研发出来，并在小牛体内进行了测试，攻毒结果表明，该疫苗具有免疫保护作用，能够减少BoHV-1病毒滴度且对免疫原性没有任何影响[9-10]。在BoHV-1感染率高的国家，gE缺失标记活疫苗，已被用于这一疾病的根除计划[11]，该疫苗的临床试验也已开展[12]。2007年，在3个欧洲国家进行的一项研究表明，接种疫苗的动物血清转化率有所下降，这表明了疫苗接种对遏制病毒的传播是有效的[13]。然而，使用BoHV-1gE-标记活疫苗对BoHV-5引起的脑炎的保护作用有限，当免疫动物受到BoHV-5病毒威胁时，只能减轻临床症状，但对隐藏在鼻腔内的病毒及发生的脑炎病变无影响[14-15]。因此，在BoHV-5流行率较高的地区使用BoHV-1gE?标记活疫苗可能是不合适的。

2007年，Franco等[15]报道构建了BoHV-5gI/gE/US9缺失毒株。2010年进行了一系列以构建病毒作为灭活疫苗的试验，结果显示，以高剂量的BoHV-5强毒株挑战后，该疫苗能保护实验动物免受脑炎的侵害，同时鼻腔内隐藏的病毒量也显著减少。虽然BoHV-1gE标记活疫苗已成功应用，但是这个疫苗仍然存在一系列问题。甚至是一些批次的疫苗污染了牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV），导致BVDV的爆发。

糖蛋白D（gD）是病毒囊膜表面抗原之一，它参与病毒进入细胞的过程，被认为是牛和人疱疹病毒疫苗研发的主要靶标，这主要是因为它能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应[16]。基于这一糖蛋白的亚单位疫苗，DNA疫苗和载体疫苗已经研制成功，并辅以不同的佐剂进行了评价。本文从牛疱疹病毒的结构、功能和免疫特性等方面综述了其在病毒发病机制中的作用及其在牛疱疹病毒疫苗中的应用。

1 gD的结构

疱疹病毒科是复合病毒粒子结构病毒的典型代表。病毒粒子由二十面体衣壳包裹大的双链DNA基因组成，衣壳又由脂质双层膜所包裹，大量的糖蛋白镶嵌在脂质双层膜中[17]。α疱疹病毒进入细胞是一个复杂的过程，至今仍没有清晰的结论。这些病毒作为一个自由粒子感染细胞，然后通过细胞间的接触向邻近的细胞扩散。关于病毒进入宿主细胞的过程目前认为有2种机制：一是病毒囊膜的融合，二是细胞内吞作用[18-19]。已知被鉴定的12种包膜糖蛋白中，至少有6种（gC、gB、gD、gH、gK和gL）参与病毒的附着和进入宿主细胞的过程。α疱疹病毒和宿主细胞的结合是由于gC或gB与宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可逆性吸附[20]。事实上，虽然gC缺失突变体也能感染细胞，但是只有当gC附着在细胞表面受体上时，α疱疹病毒的感染性才会增强[21]，这表明这种附着本身不足以使病毒进入宿主细胞，而是需要其他辅助因子才能进入细胞。病毒包膜和宿主细胞的细胞质膜融合需要其他4种糖蛋白（gD，gB和gHgL复合体），其中gD结合到细胞表面受体之一是病毒进入细胞所必须的，然后gB和gH-gL之间会发生一系列相互作用，并伴随有膜融合的发生[22]。融合机制的另一个组成部分是gK，它也与gB相互作用，通过结合其氨基末端，并改变该糖蛋白介导“病毒包膜到细胞膜融合”的能力[22]。尽管该蛋白编码基因的缺失对细胞培养中的复制并不是致命的，但却降低了病毒的效价，这表明gK缺陷的病毒粒子进入细胞的过程受损[23]。

BoHV-1和BoHV-5的糖蛋白D由417个氨基酸组成，其中79.9%的氨基酸结构已经鉴定，它们是N、O连接的寡糖，分子量约为71 kDa[24，25]。它属于I型膜糖蛋白，含有信号肽序列，BoHV-1gD的裂解位点在18和19位氨基酸之间，BoHV-5 gD的裂解位点在19和20位氨基酸之间[26]。信号肽被裂解后产生的成熟蛋白是399个氨基酸。gD的氨基端包含胞外结构域，羧基端由疏水跨膜锚定序列和胞质尾部组成，BoHV-1gD的胞质尾部约28个氨基酸、BoHV-5gD的胞质尾部约35个氨氨基酸[25，27]。该糖蛋白基因核苷酸序列的GC含量为70%[25]，和猪疱疹病毒1型（SuHV-1）（75%）及HHV-1（65%）的gD同源物相似[28]。BoHV-1和BoHV-5gD氨基酸序列在其胞外区保留了6个半胱氨酸残基，表明这些残基之间可能是由二硫键连接，可能在维持适当的3D结构及其功能中发挥作用[25]。2种gDs比对结果显示，BoHV-1和BoHV-5[26]gD的氨基端2/3（1-282位氨基酸）相对保守。2种gDs图谱的不同之处在于接近跨膜区胞外分子的C端（280和330位氨基酸），该区域是一个富含甘氨酸的伸展部位[24，26]。在BoHV-1gD中，这个区域有1个亲水峰，对于蛋白质与病毒的其他分子、宿主细胞或离子之间[27]的相互作用非常重要。BoHV-5gD的这个区域在氨基酸序列上与BoHV-1gD序列有几处不匹配，从281位氨基酸到295位氨基酸存在一系列带负电荷的残基，从而产生一系列的亲水峰，这和BoHV-1gD的1个宽峰形成对比[26]。BoHV-1gD有4个抗原结构域，5个表位，其中3个表位相互关联，2个表位相互独立，据报道它们是中和抗体的靶点[27-28]。HHV-1和BoHV-1gD有3个N-CHO位点（BoHV-1gD氨基酸位点分别为41，102和411），而BoHV-5gD仅在胞质尾部有2个N-CHO位点（BoHV-5gD氨基酸位点分别为102和411）[26]。N-CHO对gD的重要性在于其糖基化对蛋白质结构和抗原性质的影响，而不是直接与细胞受体相互作用的影响[29]。BoHV-1gD的酶促脫糖基显示：添加碳水化合物可能会掩盖参与T细胞识别的表位。目前为止，已被证明是gD细胞表面受体的有连接蛋白-1、疱疹病毒进入介导者（HVEM）和硫酸肝素。连接蛋白-1是gD在上皮细胞和神经元细胞上的主要受体[30]，可以介导HHV-1和-2以及SuHV-1（伪狂犬病病毒或PRV）、BoHV-1和BoHV-5进入宿主细胞[31]。而表达硫酸肝素盐修饰的3-o-磺酸转移酶或HVEM受体的细胞对BoHV-1不敏感[32]。连接蛋白是免疫球蛋白（Ig）样超家族中与钙无关的亲细胞黏附分子，聚集在上皮细胞的黏着连接、突触和神经元的连接点上[33]。所有的连接蛋白都有一个胞外结构域，该结构域由3个免疫球蛋白样结构域（V-C1-C2）、1个跨膜结构和1个胞质尾部区域组成。gD与连接蛋白的结合区位于V样结构域中[34]。研究发现，从HHV-1、HHV-2和SuHV-1中提取可溶性的gD能有效地与被截断的仅保留V样结构域的连接蛋白-1结合，这种结合可被该区域表位的特异性单克隆抗体所阻断[35]。

gD在BoHV-1和BoHV-5感染初期的作用及其在病毒包膜中的丰富度使其成为宿主免疫系统的靶标。宿主针对这些病毒的免疫反应可分为由中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK细胞），自然杀伤T细胞（NKT细胞）和树突细胞（DC细胞）所介导的先天行免疫反应和由B和T淋巴细胞所介导的适应性反应。对病毒感染免疫反应的第一步是避免病毒与敏感细胞之间的相互作用，然而，在初次感染期间，抗体无法干扰他们之间的相互作用。因此，免疫系统对BoHV-1感染的第一反应将包括非特异性炎症反应和细胞介导的免疫反应，gD和gB是NK细胞[36]的主要靶点。在感染后期，先天性免疫反应会引起适应性免疫反应。在牛体内，gC和gD是CD8+T淋巴细胞的主要靶标，gD所特有的多肽能刺激CD4+T淋巴细胞[37]。如上文所言，抗体反应不能阻止病毒在细胞间的传播，而且在初次感染的恢复阶段也不能被检测到抗体。但是，当再次接触病毒时，抗体在预防感染方面则起着关键作用，因为它们能中和细胞外病毒，并阻止病毒传播到相邻的动物。非中和抗体也可能与PMNs共同作用，通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）引起BoHV-1感染细胞裂解[38]。因此，主要糖蛋白不但参与诱导产生中和抗体，而且还刺激细胞介导的免疫反应，同样它们也是CTL和ADCC作用的靶点。由于这些原因，针对BoHV-1和-5的新疫苗策略应重点关注这些主要糖蛋白，特别是gD。

2 基于gD疫苗的设计

2.1 亚单位疫苗 亚单位疫苗由一种或多种纯的或半纯抗原组成。为了开发亚单位疫苗，鉴定保护性抗原的单个组分非常重要。这种疫苗可以通过常规技术生产，如纯化病原体产生的蛋白质。为了开发有效对抗BoHV-1感染的安全疫苗，可以直接从病毒感染细胞中纯化病毒包膜糖蛋白gB、gC和gD，保留它们的抗原活性，诱导牛产生中和抗体，并对强毒BoHV-1的感染产生保护作用。虽然这3种糖蛋白均能诱导产生中和抗体，但gD所诱导产生的中和抗体滴度最高，而且免疫动物的ADCC水平也最高[39-40]。虽然从受感染细胞中纯化的天然糖蛋白保留了它们的抗原特性，但这种方法成本较高。使用重组DNA技术大量生产蛋白质用于疫苗生产可能满足安全性和经济性的要求。重组BoHV-1gD已经在多个表达系统中进行表达，包括原核表达系统和真核表达系统。原核系统虽然存在操作简便，成本低，有可能实现大量的蛋白质生产等优点，但在病毒糖蛋白修饰方面有一些缺点。就像前面所提及的gD结构构象依赖于其正确的三维折叠，至少部分依赖于其插入内质网和添加碳水化合物。原核系统不具备gD折叠所需的翻译后加工的细胞机制，这一点已经得到证实。尽管大肠杆菌表达的重组gD（rgD）诱导的总抗体水平很高，但其中只有一小部分能够中和病毒[41]。由于重组gD在原核生物中表达效率较低，一些研究者对酵母、哺乳动物、植物和昆虫细胞等真核表达系统进行了尝试：将BoHV-1 gD在毕赤酵母中进行分泌表达，或与牛白细胞介素（IL）-6嵌合表达，均可诱导小鼠产生中和抗体[42，43]。此外，也有学者在毕氏酵母中表达了去除跨膜锚定序列的BoHV-5gD[44]。表达蛋白和油佐剂混合后免疫小鼠和牛，在小鼠和牛中均能诱导产生中和抗体。利用烟草花叶病毒（TMV）载体在植物细胞中表达了非糖基化的BoHV-1gD。将该蛋白用油佐剂混合后免疫小鼠和牛，也能诱导产生体液免疫反应和细胞免疫反应，但当用病毒感染后似乎只有部分动物得到了保护，但病毒中和试验没有进行评估[45]。

虽然酵母、植物和昆虫细胞能够产生具有一定真实性的gD，但大多数报道都是MDBK细胞在诱导型牛热休克70A基因启动子（HSP70启动子）控制下产生的分泌型的gD（也称为tgD）[46]。据证明，当BoHV-1gD在MDBK细胞中组成性表达时，高水平的BoHV-1gD对细胞是有毒害作用的，只有当BoHV-1gD置于诱导型启动子控制下或在基础水平表达时，才能建立稳定的表达细胞系[47]。但这一问题可以通过去除跨膜锚定序列得以解决，并能产生与全长gD具有同等免疫原性的分泌型gD[48-49]。BoHV-1tgD与多种佐剂及辅助佐剂联合应用，通过不同途径诱导全身及粘膜免疫应答。其中最有效的方法之一是将含有CpG的寡脱氧核苷酸（ODN）与经典佐剂相结合。细胞介导的免疫应答对保护机体免受多种病原体的侵袭是至关重要的，尽管目前所有获得许可的疫苗都能有效地诱导抗体应答，但只有经过修饰的活疫苗才能有效地诱导细胞介导的免疫反应。但是，当亚单位疫苗与适当的佐剂配方时，由于交叉提呈可能会诱发细胞介导的免疫反应。tgD与明矾和CpG ODN的配方（甚至单独与CpG ODN的tgD）能在犊牛体内诱导产生较强的中和抗体和细胞介导的免疫反应，从而使其抵抗BoHV-1的挑战[50]。和常规佐剂相比，CpG ODN联合油佐剂能诱导较强的Th1型免疫反应，增加IFN-γ的产生，或平衡免疫反应[51]。另一方面，针对BoHV-5的实验疫苗，当仅用油基佐剂配制重组的BoHV-5gD接种小鼠时，观察到混合的Th1/Th2免疫反应。这诱导产生了IFN-γ以及促炎细胞因子，如IL-17和集落刺激因子（GM-CSF）[25]。

2.2 DNA疫苗 DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗之所以受到关注，是因为它所产生的免疫反应与自然感染引起的免疫反应极为相似，是由病毒蛋白和糖蛋白内源性产生的[52]。最早开发的BoHV-1DNA疫苗是基于pRSV质粒设计的，该质粒包含劳斯肉瘤病毒的转录控制序列，并有较广的宿主细胞范围[53]。有研究者将BoHV-1 3种糖蛋白（gD，gB or gC）以肌肉注射的方式免疫小鼠，并对小鼠体内产生的抗体滴度进行了测试，结果发现gD的中和抗体滴度远高于gB或gC[54]。用gD的DNA疫苗肌内免疫后，体液免疫反应较低。用人巨细胞病毒（HCMV）立即早期启动子/增强子取代RSV启动子后，将分泌表达的gD（tgD）进行皮内免疫，从而改善了免疫应答。在2004年的另一项研究中，将编码截断型BoHV-1gD的DNA疫苗以肌肉、皮内和鼻内3种不同的途径免疫动物，结果只有肌肉注射的才能产生中和抗体，并在感染早期清除病毒[55]。将编码分泌型gD和gB的质粒通过鼻内途径免疫小鼠，可诱导产生高水平的中和抗体[56]。将多个拷贝的CpG基序整合到tgD编码的质粒中，也引起淋巴细胞增殖和细胞免疫，在BoHV-1攻毒后，有较高的中和效价和较少的病毒排出，但临床症状无明显差异[57]。将编码tgD的质粒与牛CD154结合，经皮内免疫接种后，该质粒能与皮肤内的表达有CD40的树突状细胞结合。与单纯的tgD相比，tgD- CD154并没有增强免疫应答或对疾病的保护[58]。

2.3 载体疫苗 载体疫苗是指利用基因工程的技术，将病原的基因克隆到另一个安全无致病能力的病毒或细菌载体中，从而能将目的基因携带到细胞中并进行表达，最终产生很好免疫效果的疫苗。这种疫苗的主要优点之一是有可能将抗原直接送到粘膜表面，并能誘导体液和细胞介导的免疫反应。由于牛腺病毒3型（BAV-3）能够在牛的呼吸道中复制，同时产生轻微或无临床症状，并在细胞培养中生长达到较高滴度[59]，因此一些研究者将BAV-3作为载体来表达gD蛋白并免疫牛。经鼻内免疫后，具有复制能力的BAV-3表达了全长gD或tgD，产生了gD特异性免疫应答，包括鼻分泌物中的IgA。然而，免疫动物在BoHV-1强毒株感染后虽得到部分保护，但IgA反应的强度仍不足以消除隐匿的BoHV-1[60]。通过气管内或皮下途径免疫牛只也观察到同样的反应模式[61]。人腺病毒5型（HAdV-5）也被用作病毒载体来传递BoHV-1糖蛋白。表达gD的HAdV-5以鼻内途径单独或联合表达gC的HAdV-5共同免疫动物均可诱导中和抗体的产生，且gD抗体滴度远高于gC抗体滴度，肌肉注射表达gD的HAdV-5也观察到同样的结果，但中和抗体滴度低于鼻内免疫所产生的抗体滴度[62]。这些实验都没有进行细胞免疫反应的评估。最近，有学者将山羊疱疹病毒1型（CpHV-1）的gD在牛疱疹病毒4型（BoHV-4）的基因组中进行表达。携带CpHV-1gD基因的重组BoHV-4皮下注射给实验动物，用相应的病毒进行攻毒后可保护试验动物不出现临床症状，并减少感染后病毒的排出[63]。虽然这增强了gD疫苗刺激宿主免疫系统反应、减少了病毒引起的临床症状和病毒的排出，但在其他α疱疹病毒如HHV-1和HHV-2上并不一定成功。当用HHV-1和HHV-2的gD抗原作为抗原疫苗时，也能诱导免疫应答，调节临床保护和减少病毒的排出。用哺乳动物细胞中表达的HHV-1gD蛋白免疫豚鼠时，诱导产生了针对HHV-1和HHV-2的中和抗体，用HHV-2经阴道感染后并没有出现临床症状[64]。然而，在人体内进行试验时并没有出现类似的结果[65]。HHV-2gD联合gB和MF59佐剂虽然能诱导HHV-2特异性中和抗体的产生，但对HHV-2只能产生部分和短暂的临床保护[66]。使用该gD加上明矾和MPL佐剂时，该疫苗具有良好的耐受性，能保护预先没有HHV-1抗体的女性免受感染，但未能保护男性和先前已经感染HHV-1的女性[67-68]。2012年，有试验再次表明，注射2次疫苗后，对HHV-1和HHV-2引起的生殖系统疾病的保护效果不明显，而注射3次后则对HHV-1有效，对HHV-2无效[69]。随后对疫苗的给药与HHV-1疾病预防的关联性进行了研究，显示的结果可能是由于疫苗中使用的HHV-2gD区域与HHV-1gD区域具有同源性。虽然该疫苗刺激产生了中和抗体，但这些抗体未能保护HHV-2引起的临床症状，正如学者所建议，这可能意味着需要开发新的疫苗策略，以刺激更高的抗体滴度来应对HHV-2的感染[70]。最近的HHV-2gD试验也表明，需要适当刺激细胞免疫以保护机体免受HHV引起的疾病。小鼠或豚鼠实验表明，与单独的gD相比，HHV-2gD与立即早期蛋白如ICP27或ICP4联合使用，更能加强T细胞免疫应答，进而增强临床保护水平[71]。

3 结语

α-疱疹病毒gD在病毒与细胞的相互作用中起重要作用，具有很強的免疫原性。在过去几十年中，gD一直作为候选疫苗来研究，只要融入一些新的免疫策略，就可以临床应用。了解gD的特性以及这种糖蛋白在疫苗研究中所取得的成就，对于进一步开发新方法以减少BoHV-1和BoHV-5在世界范围内对养牛业造成的经济损失具有重要意义。现已证明gD亚单位疫苗是非常有效的，但存在费用昂贵的缺点。这可以通过添加有效佐剂等配方的方式来克服，特别是添加CpG ODN和苦杏仁酶等制品，从而降低抗原剂量，使疫苗更便宜。有文献报道，虽然编码gD的DNA疫苗适用于诱导细胞介导的免疫应答，但仍需要改进才能实现细胞免疫和体液免疫应答之间的平衡。这意味着需要开发更好的传递系统，以提高免疫动物体内的转染效率和抗原表达水平。gD载体疫苗在粘膜免疫诱导方面具有特别的优势，但也需要改进。病毒中和抗体的产生是BoHV-1和BoHV-5临床保护的关键因素之一。这表明，在目前阶段，用佐剂配制的gD亚单位疫苗可促进免疫反应的平衡，能满足诱导强的体液免疫和细胞免疫的要求。

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（責编：张 丽）