微藻诱变育种研究进展❋

梁 英， 闫译允， 赖秋璇， 田传远， 胡乃霞， 王 玥

(海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东 青岛 266003)

微藻种类繁多、光合作用效率高、生长周期短、富含油脂、蛋白、多糖、色素、维生素等多种活性物质[1-3]，近年来在农业、生态环境保护、生物能源开发及食品药品等领域备受青睐[4-7]。随着微藻规模化养殖的不断扩大，提高养殖产量和质量的关键问题是如何获得具有高产、高活性物质含量、抗污染能力强、抗逆境胁迫等优良性状的微藻种质。因此，必须加强不同微藻藻种的育种技术研究，提高育种效率，从而获得性状优良的微藻种质，以实现微藻规模化、产业化发展。

微藻诱变育种是指采用各种物理以及化学诱变的方法引起藻种遗传性状产生变异，再通过定向筛选、培育以获得所需要的优良突变藻株的育种技术[8]。与传统的选择育种方法相比，诱变育种周期短、突变率高，在提高产量、增强抗性、改善微藻品质等方面潜力巨大[9-10]。诱变育种技术已广泛应用于富含生物活性成分的微藻、生物能源微藻等经济微藻中，成为提高育种效率、获得优良微藻种质的主要手段。国内外已有大量文献报道，运用诱变育种技术已成功获得高活性物质含量、高油脂产量及耐低温、高温等优良性状的藻种[11-14]。但目前可实现规模化养殖的微藻种类十分有限，且表型性状的不稳定性也会对微藻生产造成影响，因此，必须不断地对微藻诱变育种技术进行改进和创新。本文综述了物理诱变、化学诱变、复合诱变技术的诱变机理及其在微藻育种中的应用现状，并对微藻诱变育种中存在的问题进行了总结及展望，以期为微藻种质资源开发利用以及推动微藻诱变育种研究提供参考。

1 物理诱变育种

物理诱变主要通过各种辐射诱变剂对微藻进行辐照处理，诱发染色体异位、缺失、重组或断裂等，从而引起后代性状产生变异[15-16]。目前使用较广泛的辐射源有：紫外线、射线、重离子束等。随着诱变技术的不断发展，许多有效的诱变源如激光、超声波、太空诱变等也被应用于微藻的育种中[17-19]。此外，常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)作为一种新型的诱变育种手段，也已成功应用于微藻诱变育种的研究中[20]。

1.1 紫外线诱变

紫外(Ultraviolet，UV)诱变育种是目前使用最久、应用最广的一种物理诱变方法[21]。紫外线可穿透藻细胞直接作用于DNA，当DNA分子吸收紫外光后，易导致单链相邻或双链相对应的两个胸腺嘧啶形成二聚体，DNA在进行解旋、复制、转录时，由于嘧啶二聚体不能进行分离，从而阻碍碱基的正常配对，使基因发生突变[22-24]。紫外诱变因操作简单、低成本、高突变率、高安全性等特点，在微藻诱变育种研究中得到广泛应用[25-26]。国内外已有大量研究报道，利用紫外线对不同微藻进行诱变并获得了大量性状优良的突变藻株。如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、魏氏真眼点藻(Eustigmatosvischeri)、小球藻(Chlorellasp.)、栅藻(Scenedesmussp.)、四爿藻(Tetraselmissuecica)、集胞藻PCC 6803(Synechocystissp. PCC 6803)等，均已利用紫外诱变育种技术成功获得了具有高生物量、高油脂产量、高EPA及高精氨酸含量的优良突变株，具体研究成果见表1。

表1 紫外线诱变在微藻育种中的研究成果Table 1 Research achievements of UV mutagenesis in microalgae breeding

1.2 射线诱变

射线是一种能量高、穿透力强的电离辐射源，常见的有X射线、γ射线等[35-36]。利用射线辐射微藻细胞，可直接或间接引起遗传物质发生改变。一方面，电离辐射可直接破坏碱基、糖-磷酸、脱氧核糖等化学键，导致染色体发生断裂、重复、缺失等突变，此外，辐射可使藻细胞内的水、有机分子等组分发生电离产生具有极强还原或氧化特性的自由基，从而间接引起染色体畸变[37]。与紫外诱变相比，高能量、强穿透力的射线辐射更易造成DNA序列的改变，因此在微藻诱变育种中具有更高的突变效率。γ射线辐射因其重演性较好、辐照条件易于控制等优点成为微藻育种中最常用的诱变源之一，尤其是60Co-γ射线在寇氏隐甲藻(Crypthecodi-niumcohnii)、栅藻、微拟球藻(Nannochloropsisoculata)、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)等富含活性物质的微藻诱变育种研究中成效显著，已培育出许多高油脂、高DHA、高虾青素含量及高耐受CO2等性状优良的株系，具体见表2。

表2 60Co-γ射线诱变在微藻育种中的研究成果Table 2 Research achievements of 60Co-γ ray mutagenesis in microalgae breeding

1.3 重离子束诱变

重离子束是一种具有高传能线密度(Linear energy transfer，LET)的人工粒子辐射源，应用于育种研究的重离子主要通过加速器将原子的核外电子部分或全部剥离掉再加速而成，常见的有碳、氮、铁等重离子束[43]。重离子束的LET值远高于X、γ等传统射线，能够造成细胞核内DNA分子更致密的损伤，且多为DNA双链的平头末端断裂、大片段缺失、DNA-蛋白质交联等难以重组修复的团簇损伤[44-47]。因此，重离子束辐射诱变能够在具有较高存活率的情况下获得更高的突变效率。随着核物理学的不断发展，重离子束辐照在高等植物诱变育种方面取得了很大的进展[48-50]。近年来，在微藻育种研究中也逐渐开展了重离子辐射诱变技术，并已成功应用于微拟球藻、栅藻、羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)、三角褐指藻等的育种研究中，获得的突变株的生物量、油脂产量、岩藻黄质含量、光合效率等均显著提高，表3概述了该技术在以上微藻育种中的具体研究成果。

表3 重离子束辐射诱变在微藻育种中的研究成果Table 3 Research achievements of heavy-ion irradiation mutagenesis in microalgae breeding

1.4 常压室温等离子体诱变

常压室温等离子体诱变(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)是一种安全高效、环境友好的新型诱变育种手段。ARTP产生的放电均匀、稳定的高浓度活性粒子，可直接穿透细胞造成DNA分子损伤，引起突变，还可以通过破坏整个细胞以启动细胞内的DNA修复等多种修复机制，这些不精确的修复会触发细胞内复杂的调控系统，从而引起基因表达方式及代谢途径的改变[57-58]。因此，利用ARTP诱变技术较易获得具有良好遗传稳定性的突变株。此外，ARTP诱变育种突变率高，且对DNA造成最大损伤的情况下细胞仍能保持活性，从而为育种工作提供了更多的突变资源[59]。目前，ARTP诱变技术已成功应用于微藻的突变，在小球藻、雨生红球藻、螺旋藻(Spirulinasp.)、湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、寇氏隐甲藻等的育种研究中均取得了显著成效，获得了具有高生物量、高油脂产量及高多糖、高氨基酸、高虾青素含量等多种优良性状的突变藻种，应用前景十分广阔。该技术在以上微藻育种研究中取得的具体成果见表4。

1.5 激光诱变

激光具有单色性好、方向性好、高光亮性和高相干性等优点，将激光作为辐射源应用于微藻育种，其主要通过对藻细胞产生光、光压、热及电磁场等综合理化效应使DNA和RNA结构发生突变，从而导致性状改变以达到育种目的。一定频率的激光辐射微藻后，在上述各效应的叠加作用下，藻细胞DNA分子产生断裂、交联、聚合等一系列突变，RNA分子结构也随之产生变化，引起酶的抑制或激活，导致基因表达和藻细胞代谢途径改变，最终产生突变株。近年来，随着激光诱变育种设备的不断研制与广泛应用，使得激光诱变育种效率大大提高，且操作更加简便，如CO2、He-Ne、Nd: YAG等激光器在微拟球藻、雨生红球藻、小球藻、紫球藻(Porphyridiumcruentum)等的育种中已取得了显著的成效，突变藻株的油脂、虾青素、胞外多糖含量等均显著提高，具体研究成果见表5。

表4 ARTP诱变在微藻育种中的研究成果Table 4 Research achievements of ARTP mutagenesis in microalgae breeding

1.6 超声波诱变

超声波是一种频率高、功率大、穿透力强的机械波，在传播过程中可与介质发生作用产生热、机械和空化等理化效应。将超声波应用于微藻诱变育种，其主要通过空化效应作用于微藻细胞，即超声波在传播时由于声压发生剧烈变化从而产生空化气泡，这些空化气泡在瞬间爆破的过程中，释放出巨大能量，导致局部产生瞬时极端高温、高压、放电现象，并产生大量自由基[71]。这一系列继发效应可导致藻细胞遗传物质、酶活性及细胞膜结构改变，从而使基因表达过程、胞内外物质交换及信息传递、代谢途径等改变。已有研究表明，超声波对微藻生长、光合作用、油脂合成及转化均有显著影响[71-73]，随着超声波特性和诱变机理研究的不断深入，超声波微藻诱变育种取得了一定成效。朱甲妮[74]在频率18 kHz、功率20 W和时间10 min的超声条件下诱变栅藻，诱变株的油脂产量与出发株相比提高了26%；肖若楠[75]用频率20 kHz、功率20 W的超声波处理栅藻30 min，诱变株的细胞干重和油脂含量分别比出发株提高了33.3%和37.2%。韩飞[18]将处于对数生长末期的四尾栅藻进行频率40 kHz、功率200 W和时间20 min的超声处理，突变株的油脂含量比原始株提高了57.5%。实践表明，超声频率、处理时间不同随之产生的效应程度也不同，且不同微藻种类的耐受性也各不相同，因此，选择合适的超声参数和剂量是育种成功的关键。

表5 激光诱变在微藻育种中的研究成果Table 5 Research achievements of laser mutagenesis in microalgae breeding

1.7 太空诱变

微藻太空诱变育种是指通过返回式航天器如卫星、飞船等将藻种搭载到宇宙空间，利用强辐射、微重力等空间条件实现微藻的有益突变。宇宙射线种类多且穿透力强，当高能射线辐射微藻细胞后极易导致DNA分子损伤，而空间微重力在DNA损伤的情况下阻碍了DNA修复系统的启动与运转，最终使基因产生变异[76]。刘波等[19]通过太空搭载小球藻，获得了一株油脂和脂肪酸含量分别比出发株增加6.5%和3.76%的优良突变株。谭丽等[77]经过太空搭载钝顶螺旋藻成功选育出优良突变株H11，与原始株相比，H11的生物量、总多糖产率分别提高了15.39%和176.50%。太空诱变技术作为一种有效的育种手段，具有突变频率高、变异稳定性好、多数性状可稳定遗传等优点，但由于空间条件难得且难以模拟，从而限制了太空诱变在微藻育种中的应用。

2 化学诱变育种

化学诱变是一种利用化学诱变剂处理微藻以获得突变藻株的育种方法，具有突变范围广、易操作、成本低等特点[20]。目前广泛应用于微藻育种的化学诱变剂主要是一些烷化剂，如甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)、亚硝基胍(N-methyl-N’-Nitro-nitrosoguanidine，NTG或MNNG)等。这些烷化剂通常具有一个或多个高活性的烷化基团，在诱变过程中通过取代DNA分子中的氢原子以造成碱基的错配、置换等，从而引起突变[78]。另外，烷化基团还可与DNA结构中的氧原子发生烷化反应，形成极易水解的磷酸酯从而造成DNA链的断裂[79]。与物理诱变相比，化学诱变多为基因的点突变，对微藻的基因组损伤较小，且突变位点具有特异性。近年来，栅藻、小球藻、微拟球藻、波氏真眼点藻(Eustigmatospolyphem)、三角褐指藻、小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumf.minutissima)、节旋藻(Arthrospirasp.)、纤细裸藻(Euglenagracilis)等均已利用化学诱变技术成功获得了耐高温、低温及高产虾青素、油脂、EPA、类胡萝卜素、蛋白质等的优良突变株，详见表6。

表6 化学诱变在微藻育种中的研究成果Table 6 Research achievements of chemical mutagenesis in microalgae breeding

3 复合诱变育种

复合诱变是指采用两种或两种以上的诱变方法对微藻进行育种，可以是两种及以上物理诱变方法或化学诱变方法，也可以物理诱变与化学诱变等方法相结合。单一诱变育种产生的基因突变往往比较单一，运用复合诱变方法有利于打破突变局限性，获得更多的正突变藻株。目前应用在微藻育种中的复合诱变方法主要有两种，一种是使用多种方法依次诱变处理出发藻株，最后筛选优良藻株。另外一种复合诱变方法是每次诱变处理后都进行筛选，即第一种方法诱变处理后筛选出优良藻株，然后对筛选出的优良藻株进行第二种方法诱变处理，再次进行筛选。许多研究表明，与单一诱变相比，复合诱变可以增加基因突变类型，拓展突变谱，且诱变方法顺序不同获得的基因突变类型也往往不同，因此，复合诱变更有利于筛选获得性状优良的突变藻株[92-93]。目前，复合诱变主要应用于原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)、埃氏小球藻(Chlorellaemersonii)等富含油脂藻种的育种研究中，获得的突变株其油脂含量显著提高，表7概述了复合诱变育种在以上微藻中的具体成果。

表7 复合诱变在微藻育种中的研究成果Table 7 Research achievements of combined mutagenesis in microalgae breeding

4 不同诱变育种方法的优缺点比较

在微藻育种中应用物理诱变方法，具有简单易操作、且安全性高的优点，但ARTP、射线、太空诱变等物理诱变方法，存在设备昂贵、维护成本高、条件难得、难以推广的弊端；紫外诱变成本虽低，但存在突变单一且不稳定的缺点。化学诱变方法成本低，但有利突变少，且大多数诱变剂具有强烈致癌毒性，对环境及研究人员伤害较大。复合诱变方法可以增加基因突变类型，拓展突变谱，且变异稳定性好，但操作复杂，耗时费力。因此，微藻诱变育种技术还需不断改进和创新。表8总结了不同诱变育种方法的优缺点。

表8 不同诱变育种方法的优缺点Table 8 Advantages and disadvantages of different mutation breeding methods

5 问题与展望

近年来，微藻诱变育种研究已经取得了较大进展，不同的诱变育种方法在提高突变效率、创造微藻新种质方面均发挥了重要作用，但目前仍存在许多问题制约着微藻种质资源开发利用，阻碍了微藻诱变育种研究进程。①不确定性：突变方向不确定，具有随机性，无法定向获得所需要的目的性状，且有意义的突变较少。②不可重复性：不论是物理诱变还是化学诱变，不同剂量、不同批次、不同时间所产生的突变率和突变方向各有不同，难以重复。③矛盾性：突变株品质的提高往往伴随着产量的下降，即品质和产量相互矛盾。④盲目性：对大部分诱变方法作用机理的研究比较浅显，育种工作存在一定的盲目性。⑤筛选困难：利用传统方法在产生的大量突变藻株中筛选出目的藻株存在工作量大、耗资、耗力、耗时等缺点，急需建立高效、准确的高通量筛选方法。因此，如何进行高效、定向诱变育种，提高有利突变，准确快速筛选出目的藻株是今后研究的重点与难点。

解决微藻诱变育种过程中存在的问题，一方面需要研究人员在实际的育种工作中结合不同微藻的特性来选择适合的诱变方法，综合运用多种有效的诱变技术，取长补短，以实现选育效率的最优化。另一方面，应将微藻诱变育种与当前先进的生物技术相结合，如可以通过基因组重测序技术、转录组测序、蛋白质组分析等技术从DNA、蛋白水平上揭示表型与基因型之间的联系，掌握诱变作用机理，从而实现高效、定向诱变育种。此外，光学传感器检测技术，如红外光谱分析(Infrared spectra analysis)[96-97]、核磁共振(Nuclear magnetic resource，NMR)[98]、拉曼光谱[99-101]等在微藻表型检测方面已进行了较多的研究，以及近年来出现的分子标记技术，这些技术的发展为建立目的突变藻株的高效、定向筛选奠定了基础。相信在科学快速发展的推动下，微藻诱变育种研究将进入高速发展阶段。