他克莫司促进颅脑损伤大鼠诱导周围神经再生的研究

何新泽 林书卿 杨涛 王成刚 李芹 薛惠萍 高丽丽 李玲玲(滨州市中心医院 山东 滨州 251700）

临床上常见到颅脑损伤合并周围神经损伤的患者，神经损伤独特的病理生理过程，导致神经功能恢复不全，生活质量下降[1]。王维、何新泽等通过建立脑损伤模型发现大鼠在颅脑损伤合并的周围神经损伤，修复速度加快[2]；大量研究证实他克莫司促进神经损伤修复再生[3]。他克莫司主要通过免疫抑制、神经营养来促进周围神经损伤后的再生[4-7]。本实验通过比较神经恢复情况，探索颅脑损伤促进神经损伤恢复的机制。

1.资料和方法

1.1 造模动物及材料

实验在2018年10月—2019年02月在滨州市中心医院完成。

实验动物：选用SPF级雄性SD大鼠180只，200～220g（北京维通利华SCXK(京)2012-0001）。饲养条件：昼夜各12 h、温度23±1℃。将大鼠完全随机分为4组，每组45只。实验经过滨州市中心医院伦理委员会批准，按照国际动物实验标准执行。

主要设备及试剂：手术显微镜（LZL-6A型，镇江中天公司），光学显微镜（BH-3型，Olympus公司），他克莫司100mg（Selleck)，头孢唑啉纳（鲁抗制药，国药准字H19993050）、甲苯胺蓝（Sigma）、BL-420F系统（成都泰盟科技有限公司）、荧光金（Sigma），冰冻切片机（Leica819）。

1.2 造模方法：

1.2.1造模步骤：禁食水4小时，术区备皮剪毛。术前30分钟，体重100g给予肌肉注射头孢唑啉钠10mg，体重100g给予10%水合氯醛按照0.35ml腹腔全麻；A组（颅脑损伤+坐骨神经损伤）：碘伏消毒，在头部正中矢状切开，颅骨开窗处位于冠状线后1.5mm、中线偏左5mm，骨窗直径5mm，撞击造成中度脑损伤；右侧臀部，显微镜下完全切断坐骨神经，9～0无损伤线缝合坐骨神经外膜4～6针[8]。B组 （坐骨神经损伤）：显微镜下完全切断右侧坐骨神经，缝合坐骨神经外膜。

1.2.2造模后的干预：他克莫司用0.9%氯化钠稀释，0.9%氯化钠他克莫司（1ml：1mg），现用现配制；造模手术12小时后，A1组大鼠按体重100mg给予他克莫司0.5mg腹腔注射，A两组给予等量生理盐水腹腔注射，B1组大鼠按体重100mg给予他克莫司0.5mg腹腔注射，B两组大鼠给予等量生理盐水腹腔注射。每日应用1次，持续2周。

1.3 观察指标

1.3.1坐骨神经干动作电位恢复率测定：造模后8周、12周进行测定，每组每次随机取5只大鼠，麻醉后，暴露坐骨神经，在神经吻合口远端0.5cm放置刺激电极1，吻合口近端放置刺激电极2，将记录到的电信号直接输入BL-420F系统中。

1.3.2 坐骨神经的甲苯胺蓝染色：造模后4周、8周、12周，每组每次随机取5只大鼠，横行切片4um,1%甲苯胺蓝染色20分钟，快速酒精分色，中性树胶封片，观察神经纤维的髓鞘再生情况。

1.3.3荧光金示踪：造模后12周，微量注射器在坐骨神经断端以远0.5cm处，注入4%的荧光金溶液5μl，2分钟后缓慢退针。术后7天，灌流固定，取坐骨神经对应脊髓节段，冰冻切片脊髓横断面20μm。荧光显微镜下观察脊髓前角荧光金阳性运动神经元数目。

1.4 统计学分析

数据采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

造模后大鼠基本生活状态的观察：造模后所有动物均存活，切口无感染。造模1周后B两组大鼠出现足部红肿明显，其他组红肿较轻。造模3周后，A2、B1、B两组大鼠足跟出现程度不同的溃疡面，A1组大鼠足部未见明显溃疡；造模12周后，各组大鼠足部溃疡基本痊愈，B两组大鼠出现足部的自食现象。

2.1 坐骨神经干的动作电位幅值恢复率

造模第8周，各组大鼠坐骨神经干的动作电位幅值恢复率差异有统计学意义（P ＜0.01），A1优于A2、B1、B两组、A2优于B1、B两组、B1优于B两组；第12周时，A2与B1组大鼠坐骨神经干的动作电位幅值恢复率接近（P＞0.05），A1优于A2、B1、B两组，A2优于B两组，B1优于B两组(P ＜0.01），见表。

表 脑损伤、FK506对周围神经损伤大鼠神经干动作电位恢复率的影响（±s）

表 脑损伤、FK506对周围神经损伤大鼠神经干动作电位恢复率的影响（±s）

组别8周12周 A182.56±1.6388.37±1.59 A264.21±3.0276.24±3.52 B147.64±2.3575.60±2.53 B245.33±3.0348.60±3.01

脑损伤、FK506对周围神经损伤大鼠神经干动作电位恢复率（%）的影响（实验条件：屏蔽橱内进行，室温25±0.5℃，刺激强度1.2mv、波宽0.05ms）。

2.2 造模4周后，A1组可见Schwann细胞形成的神经内膜管，A2、B1组未形成神经内膜管，B两组可见大量单核细胞核、散在Schwann细胞核；造模后8周、12周，A1组再生有髓神经纤维髓鞘较A2、B1、B两组厚且规则，A2、B1组髓鞘厚度无显著差异，A2、B1组髓鞘较B两组厚（见图1）。

图1. 坐骨神经甲苯胺蓝染色（×400）

4周：A1组可见Schwann细胞形成的神经内膜管，A2、B1组未形成神经内膜管，B两组可见大量单核细胞核、散在Schwann细胞核；8周、12周：A1组再生有髓神经纤维髓鞘较A2、B1、B两组厚且规则，A2、B1组髓鞘厚度无显著差异，A2、B1组髓鞘较B两组厚。

2.3荧光金示踪标记：光镜下，观察各组相应脊髓节段前角神经元细胞胞浆中荧光颗粒，（见图2）。每高倍视野下进行计数，统计统计分析结果；造模后第12周，各组脊髓神经元胞浆荧光金标记阳性率率差异有统计学意义，A2与B1组大鼠脊髓神经元胞浆HRP标记阳性率接近（P＞0.01），A1高于A2、B1、B两组，A2高于B两组，B1高于B两组(P＜0.01）。

图2 术后12周脊髓前角荧光金阳性神经元（×100）

第12周时，A两组HRP标记脊髓前角阳性率77.24±1.52%与B1组大鼠脊髓神经元胞浆荧光金标记阳性率78.60±2.23%接近（P＞0.01），A1组荧光金标记脊髓前角阳性率82.37±1.33%高于A两组77.24±1.52 %、B1组78.60±2.23%、B两组42.63±2.12%，A两组荧光金标记脊髓前角阳性率高于B两组42.63±2.12%，B1组荧光金标记阳性率78.60±2.23%高于B两组42.63±2.12%(P＜0.01）。

3.讨论

何新泽等通过动物实验发现大鼠脑损伤后伴随损伤坐骨神经的修复重建明显加快，但具体修复机制尚不清楚[3-5]。本实验通过比较颅脑损伤联合应用他克莫司的坐骨神经损伤恢复情况。在所有的实验观测项目中，A1组（颅脑损伤联合他克莫司）大鼠的坐骨神经修复效果要优于其他组，证实颅脑损伤可以与他克莫司协同促进坐骨神经损伤后的修复，其作用机制与他克莫司不完全相同。

周围神经SunderlV的损伤，切断了神经内分泌的营养支持。神经内分泌产生的物质不能输送到靶器官上，靶器官将失去活性和营养的支持。目前他克莫司促进神经修复明确是两个功能领域，发挥神经营养功能，形成一个FKBP12的综合体，加入功能区域后表达GAP-43，并促进形成和扩大神经的生长由神经脉冲生成的生物电能，再生轴突的内径上升，形成厚厚的神经膜层，作用范围增加[1，3]。这证实了他克莫司有助于恢复周围神经的营养功能，坐骨神经动作电位恢复率、神经甲苯胺蓝染色，提示促进周围神经损伤的作用，结合功能或复杂的FKBP12 地区来促进表达GAP-43。

在周围神经损伤后，轴突的退化立即发生，轴突碎片是由巨噬细胞吞噬清除的，新的轴突、未退化的神经元延伸到由Schwann细胞组成的内膜神经的间隙，靶器官逐渐建立联系和营养[1-3]。靶器官的恢复荧光金神经显示，A1组在他克莫司的免疫抑制效果方面优于A2/B1/B两组，他克莫司结合FKBP12，形成钙复合物抑制碱（CAN），抑制T细胞的衰减，并抑制IL-2、IL3的表达，以生产免疫抑制物[4-7]被神经接收。

周围神经的损伤伴随着血液神经屏障的破坏，刺激纤维增生和巨噬细胞的扩散，形成影响神经修复的疤痕[4-7]。他克莫司可以抑制纤维素的扩散、迁移和生物活性，抑制纤维素的扩散，并通过免疫抑制作用促进神经损伤的重建和修复。神经内分泌系统的调节，创造微型环境的因素、Schwann细胞的信号有助于促进轴突再生[1]。轴突内物质更好地恢复运输功能和靶器官的反馈是相互促进的[1，5]。荧光金染色证明A1比 A2/B1/B两组免疫神经内分泌系统在脑损伤期间有密切的关系[6]，自主神经系统的中心结构被摧毁，导致免疫调节紊乱、改变或丧失，功能脑细胞的变性，导致caspase瀑布反应性的激活，导致神经凋亡。

本试验结果提示大鼠颅脑损伤伴随周围神经损伤动物早期应用他克莫司后，周围神经修复再生方面较好，脑损伤、他克莫司均可促进周围神经损伤的修复，并且协同促进神经损伤的修复效果更好，为脑损伤合并周围神经损伤的患者提供了新的治疗思路。但脑损伤促进周围神经损伤的具体机制仍需进一步深入研究。