青楷槭皮热水提取物的抗氧化性和抗菌性研究

张鑫， 孙方丹， 宋雨阳， 金铁岩

( 延边大学 农学院， 吉林 延吉 133002 )

青楷槭(AcertegmeutosumMaxim)属于槭树科、落叶乔木[1]，主要产于中国长白山和俄罗斯远东地区[2].青楷槭在民间常被用于治疗创伤性出血、脓肿、皮炎等[3-4].目前，从青楷槭中已分离出多种具有生物活性的成分，如黄酮、木质素等[5-8].研究表明，黄酮类化合物对由酒精引起的肝损伤具有保护作用[9].目前为止，未见有关青楷槭皮热水提取物的抗氧化性和抗菌性的报道.基于此，本文研究青楷槭皮热水提取物的抗氧化性和抗菌性，为开发和利用青楷槭皮提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青楷槭采集于珲春市密江镇下洼子村，由延边大学张华老师鉴定；福林试剂、芦丁、单宁酸、抗坏血酸(Vc)、DPPH、ABTS，上海源叶生物科技有限公司生产；过硫酸钾、氯化铁、碳酸钠、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、三氯乙酸、乙酸乙酯、石油醚、二甲基亚砜(DMSO)均为分析纯，科密欧化学试剂有限公司生产.

1.2 仪器与设备

U-3900紫外可见分光光度计，日立天美公司； QFST-250SQ索式提取仪，浙江普托仪器有限公司； KDN-08A凯式定氮仪，上海明嘉电子有限公司； MA45红外水分测定仪，深圳市分析仪器制造有限公司； SH-1000酶标仪，天美科技有限公司.

1.3 实验细菌及培养基

Staphylococcusaureus(金黄色葡萄球菌)4220；Streptococcusmutans(变形链球菌)3289；Escherichiacoli(大肠杆菌)1924； MHB肉汤培养基； BHI脑心浸出液培养基.

1.4 实验方法

1.4.1青楷槭皮热水提取物的制备 将青楷槭皮粉碎，过孔径180 μm筛.取青楷槭皮粉200 g，按1∶10料液比，于95 ℃下水浴加热6 h，冷却过滤.

1.4.2总酚含量的测定 采用福林酚法[10]测定总酚含量.称取0.1 g青楷槭皮粉末，制成1 mg/mL的样品溶液.吸取2 mL样品溶液于试管中，加入2 mL 10%福林试剂，充分摇匀后加入1.6 mL 7.5%碳酸钠溶液，摇匀静置0.5 h后于750 nm处测定溶液的吸光度，根据线性回归方程计算总酚的含量.

1.4.3总黄酮含量的测定 采用紫外分光光度法[11]测定总黄酮的含量.吸取4 mL样品溶液(1 mg/mL)于试管中，依次加入0.5 mL 5%亚硝酸钠溶液和0.5 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀静置6 min后加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，用水加至10 mL，摇匀静置10 min后于510 nm处测量溶液的吸光度，根据线性回归方程计算总黄酮的含量.

1.4.4DPPH清除率的测定 称取0.003 9 g DPPH，用无水乙醇溶解后转移入100 mL棕色容量瓶，定容后制得1×10-4mol DPPH标准溶液，在4 ℃下避光保存.配制0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL的样品溶液，然后取4 mL不同浓度的样品溶液，分别加入4 mL DPPH，混匀，避光放置0.5 h.用紫外分光光度计于517 nm处测量溶液的吸光度Ai， 同时测量4 mL无水乙醇与4 mL样品混合液的吸光度Aj以及4 mL DPPH与4 mL无水乙醇混合液的吸光度Ac.DPPH自由基清除率(CLDPPH)的计算公式为

CLDPPH=(Ai-Aj)/Ac×100%.

(1)

1.4.5ABTS清除率的测定 取0.2 mL 7.4×10-3mol/L ABTS 置于试管中，加入2.6×10-3mol/L过硫酸钾0.2 mL，均匀混合，在室温下黑暗静置12 h后用无水乙醇稀释50倍即制得ABTS工作液(在734 nm下ABTS工作液的吸光度A=0.7±0.02).配制0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL的样品溶液.取2 mL不同质量浓度的样品溶液，加入8 mL ABTS工作液，摇匀静置6 min后于517 nm处测定其吸光度Ai； 再用水替换空白组的样品溶液，测定其吸光度A0.ABTS自由基清除率(CLABTS)的计算公式为

CLABTS=(A0-Ai)/A0×100%.

(2)

1.4.6铁离子还原能力的测定 取磷酸二氢钠1.74 g、磷酸氢二钠2.7 g、氯化钠1.7 g，定容成400 mL溶液，得到磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)；称取1 g铁氰化钾溶于99 g水中，制得0.1%的铁氰化钾溶液.配制0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/mL的样品溶液.取5 mL不同质量浓度的样品溶液，加入5 mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和5 mL 0.1%铁氰化钾溶液，50 ℃水浴0.5 h后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，离心10 min.取5 mL上层清液，加5 mL水和1 mL 0.1%氯化铁溶液，反应10 min后于700 nm处测量溶液的吸光度，Vc作为对照.

1.4.7抗菌活性的测定 将2 g青楷槭皮热水提取物溶解在水中，用等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取3次，得到石油醚层、乙酸乙酯层和水层浸膏，然后分别用相应体积的DMSO溶解.将100 μL培养液加入无菌96孔板中，通过双倍连续稀释法[12]进行实验，并建立空白对照组.用酶标仪在650 nm处测量96孔板加入细菌后的吸光度，实验组的吸光度值为A′1， 空白对照组的吸光度值为A′0.将96孔板置于37 ℃培养箱中培养20 h后，再次测定实验组的吸光度值A1和空白对照组的吸光度值A0.抑菌率(IR)的计算公式为

(3)

2 结果与分析

2.1 青楷槭皮总酚和总黄酮含量

图1为芦丁和单宁酸标准曲线.由图1可知，标准物溶液浓度与吸光度值之间具有线性相关.单宁酸标准曲线方程为y=0.001 1x+0.027 2，R2= 0.995 3； 芦丁标准曲线方程为y=0.001x-0.003 2，R2=0.999 6.根据方程计算得青楷槭皮热水提取物的总酚和总黄酮含量分别为(289.02±5.72) mg/g， (33.56±3.32) mg/g.

图1 芦丁和单宁酸的标准曲线

2.2 青楷槭皮热水提取物的DPPH清除能力

图2为青楷槭皮热水提取物的DPPH清除率.由图2可以看出，在测定浓度范围内，提取物的DPPH清除率随提取物浓度的增加而增加，说明青楷槭皮热水提取物的DPPH清除率与提取物浓度之间存在良好的量效关系.当浓度范围在0.01～0.5 mg/mL时，提取物对DPPH的清除率显著低于相同浓度的Vc；当浓度大于0.05 mg/mL时，提取物对DPPH的清除率与Vc接近.

图2 青楷槭皮热水提取物的DPPH清除率

2.3 青楷槭皮热水提取物的ABTS清除能力

图3为青楷槭皮热水提取物的ABTS清除率.由图3可以看出，在测定浓度范围内，青楷槭皮热水提取物对ABTS的清除率与Vc接近.当提取物浓度超过0.1 mg/mL时，其对ABTS的清除率达到94.76%，高于青楷槭树叶提取物对ABTS的清除率(最高清除率为93.84%)[13].

图3 青楷槭皮热水提取物的ABTS清除率

2.4 青楷槭皮热水提取物对铁离子的还原能力

图4为青楷槭皮热水提取物对铁离子的还原能力.由图4可以看出，在测定浓度范围内，随着提取物浓度的增加，其对铁离子的还原力逐渐增加，但其还原能力略低于Vc.当浓度为1 mg/mL时，铁离子还原力的吸光值达到最高，为2.60.

图4 青楷槭皮热水提取物的铁离子还原能力

2.5 青楷槭皮热水提取物的抗菌活性

表1为青楷槭皮热水提取物对不同细菌的MIC.由表1可知，提取物的石油醚层对变形链球菌(3289)、金黄色葡萄球菌(4220)、大肠杆菌(1924)均无抗菌活性，提取物的乙酸乙酯和水层对大肠杆菌(1924)有抗菌活性，其MIC分别为128 μg/mL和16 μg/mL，但对变形链球菌(3289)、金黄色葡萄球菌(4220)没有抗菌活性.该结果与PARK等[14]的研究结果一致.

表1 青楷槭皮热水提取物对不同细菌的MICμg/mL

注： >256为无抗菌活性.

3 结论

本文研究表明，青楷槭皮热水提取物中的总酚和总黄酮含量分别为(289.02±5.72) mg/g，(33.56±3.32) mg/g.青楷槭皮热水提取物具有很好的抗氧化性，且其抗氧化性与提取物浓度呈明显的量效关系.青楷槭皮热水提取物对变形链球菌(3289)、金黄色葡萄球菌(4220)没有抗菌活性，而其乙酸乙酯层和水层对大肠杆菌(1924)有抗菌性，MIC分别为128 μg/mL和16 μg/mL.本文研究结果可为进一步分离和纯化青楷槭皮中的抗氧化和抗菌性物质，以及开发利用青楷槭皮提供理论依据.