长白瑞香提取物的急性毒性及其体外抗弓形虫的研究

赵鹏宇， 徐乐乐， 金春美， 张昌浩， 金莉莉

( 延边大学 药学院， 吉林 延吉 133002 )

长白瑞香(DaphnekoreanaNakai)为瑞香科瑞香属落叶小灌木，又名辣根草、祖师麻，是长白山区的特有植物[1].长白瑞香性味辛、热，有温中散阳、行癖止痛等功效[2]，亦有镇痛、抗风湿性关节炎、抑制蛋白激酶活性、抗疟、保肝等药理活性[3-5].目前学者已对长白瑞香的化学成分进行了较多研究，发现其主要含有瑞香素、瑞香苷、西瑞香素、伞形花内酯等[4-8].

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)简称弓形虫或弓形体，广泛寄生于人和多种动物的有核细胞内，是一种重要的机会致病原虫( opportunistic protozoa)，可引起弓形虫病(toxoplasmosis).目前治疗弓形虫病主要依靠抗生素、磺胺嘧啶、乙胺嘧啶等化学药物，但研究显示这些药物治疗弓形虫病的效果并不理想，且毒副作用大[9].近年来一些植物相继被报道具有良好的抗弓形虫活性[10-11]，但对于长白瑞香抗弓形虫作用的研究尚未见报道.基于此，本文对长白瑞香提取物的急性毒性及其体外抗弓形虫作用进行研究，以此为长白瑞香的开发和应用提供理论依据.

1 材料与仪器

1.1 实验材料

长白瑞香样品采于吉林省安图县二道白河镇(采集日期为2018年8月)，经延边大学生药教研室吕惠子教授鉴定；昆明小鼠(体重为18～23 g)，延边大学实验室动物中心提供；弓形虫RH株、HeLa细胞，延边大学药学院细胞培养室提供；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸二钠盐溶液，北京Solarbio公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，美国GIBCO公司；杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)，Thermo公司；乙胺嘧啶片，广州白云山光华制药股份有限公司；无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；无菌生理盐水，龙井草仙药业有限公司；MTT溶液，美国Amresco公司.

1.2 实验仪器

分析天平，上海精天电子仪器有限公司；低速离心机，德国SIGMA公司；DK-S28电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司； SH-1000 Lab型酶标仪，日本Corona Electric公司；WZ-180SP旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；HH-W型恒温水浴箱，浙江金坛市恒丰仪器厂；SW-CJ净化工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司.

2 实验方法

2.1 长白瑞香提取物的制备

将2.0 kg长白瑞香干燥药材粉碎，加入质量分数为85%的乙醇超声提取3次，减压蒸发得到550.0 g乙醇提取物.在提取物中加入适量蒸馏水并将乙醇提取物均匀混悬，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶剂等体积萃取3次.将各层萃取液合并，减压浓缩后得到石油醚萃取物27.3 g，二氯甲烷萃取物11.0 g，乙酸乙酯萃取物50.2 g，正丁醇萃取物82.3 g.

2.2 长白瑞香乙醇提取物的急性毒性实验

按照《食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序》(GB 15193.1—2014)进行实验.取昆明小鼠18只，随机分成3组(对照组、低剂量组、高剂量组，每组6只)并称重.采用最大耐受量法[12]测定小鼠口服长白瑞香乙醇提取物的急性毒性.根据预实验结果，将低剂量组的给药量设置为5 g/kg，高剂量组的给药量设置为10 g/kg.小鼠禁食不禁水12 h后，对小鼠采用灌胃给药法等体积给药，各组给药体积均为0.4 mL/10 g.观察、记录小鼠在给药期间的反应症状(观察期为14 d)，并在第15 d解剖所有小鼠，观察其心、肝、脾、肺、肾等脏器有无病理变化[13-14].

2.3 长白瑞香提取物的体外抗弓形虫实验

2.3.1弓形虫悬液的制备 将保存于液氮罐中的弓形虫冻存管置于37 ℃预热的恒温水浴锅内迅速溶解，然后将融化后的弓形虫悬液接种于小鼠腹腔；连续传代至小鼠体内弓形虫毒性稳定后，处死发病体征明显且病危的小鼠.用无菌生理盐水清洗小鼠腹腔并收集腹腔液，然后以500 r/min离心(5 min)腹腔液；取上清液再以2 500 r/min离心20 min，弃上层离心液后向虫体沉淀中加入适量含2%(体积分数)FBS的DMEM并混匀，备用.

2.3.2HeLa细胞的培养 取HeLa细胞，将其培养在含10%(体积分数)FBS的DMEM中，然后加入1 mL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸二钠盐溶液，并置于37 ℃培养箱中培养；将细胞悬液置于15 mL离心管中，以1 000 r/min离心3 min.弃上清液，取适量细胞放入新的培养皿中，取适量细胞放入含10%(体积分数)FBS的DMEM中进行传代培养.

2.3.3HeLa细胞增殖的测定 HeLa细胞增殖的测定采用MTT法.收集生长状况稳定的HeLa细胞，然后将HeLa细胞接种于96孔板中(每孔为3×103个细胞)，并置于二氧化碳培养箱中培养24 h以获得单细胞层.将含10%(体积分数)FBS的DMEM更换为含2%(体积分数)FBS的DMEM，并在每个孔中加入5倍HeLa细胞个数的弓形虫，然后在二氧化碳培养箱内继续培养24 h.培养完成后，去掉培养液并加入不同浓度(20、200、500 μg/mL)的长白瑞香提取物以测定受试药物细胞毒性，同时以乙胺嘧啶为阳性对照，每个浓度设3个平行孔.另设正常组作为空白对照，不添加任何物质.24 h后，在孔中加入10 μL MTT溶液，37 ℃温育4 h后利用酶标仪测定各孔吸光度值(λ=548 nm)，并计算3个孔的平均吸光度(OD)值，以此来表示各组虫体的生长情况.

相同实验条件下，同时测定不同组别的长白瑞香提取物对未感染的HeLa细胞的细胞毒性.根据最终测定的OD值，按照式(1)计算各组细胞的抑制率(cell inhibitory rate，CIR)，按照式(2)计算药物的选择性指数(selectivity index，SI).

(1)

SI=A1/A2.

(2)

其中：A1和A2分别为提取物对未感染弓形虫的HeLa细胞和对感染弓形虫的HeLa细胞的IC50.

3 结果与分析

3.1 长白瑞香乙醇提取物的急性毒性测定

3.1.1小鼠体重变化及死亡率 在小鼠的急性毒性试验观察期内(14 d)，各组小鼠外观正常，生长发育良好，未见有异常行为和中毒表现，且均无死亡出现.对高剂量组的小鼠进行剖检未发现肉眼可见的病变.观察期内各组小鼠体重变化如图1所示.由图1可以看出，观察期内高、低剂量组和对照组的小鼠体重变化趋势基本一致.

3.1.2小鼠行为学及外观观察 观察期内各实验组(高、低剂量组和对照组)小鼠的摄食、饮水、其他活动以及粪便、毛色、皮肤等均未见异常.由此根据急性毒性分级的标准[15]可确定长白瑞香的LD50大于10 g/(kg·BW)，属实际无毒.

3.2 长白瑞香提取物的体外抗弓形虫作用

3.2.1HeLa细胞的生存抑制效果 图2为长白瑞香提取物对感染弓形虫后的HeLa细胞的生存抑制效果.图2采用Graphpad prism 7作图，用SPSS 24.0软件对数据进行单因素方差处理.当P<0.01时，图中用##表示；当P<0.001时，图中用###表示.

图1 3组小鼠口服长白瑞香乙醇提取物后的体重变化趋势

图2 长白瑞香提取物对感染后的HeLa细胞的生存抑制效果

由图2可以看出：质量浓度在20、200、500 μg/mL时，长白瑞香乙醇提取物及其石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取物对感染弓形虫后的HeLa细胞的生存均有抑制作用，且质量浓度在20～500 μg/mL范围内，对感染后的HeLa细胞有剂量依赖性的抑制作用，其中二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物的效果较为明显(P<0.001)，正丁醇萃取物在质量浓度为20 μg/mL时对HeLa细胞生存的抑制作用最弱(P<0.01).

3.2.2抗弓形虫作用的选择性 表1给出了不同组别对感染弓形虫前后的HeLa细胞的IC50值及SI.由表1可知：二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物对未感染弓形虫的HeLa细胞的IC50高于对照品乙胺嘧啶对未感染弓形虫的HeLa细胞的IC50(275.2 μg/mL)，表明二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物对宿主细胞毒性较小；长白瑞香乙醇提取物及其4个萃取物的SI均高于对照品乙胺嘧啶的SI，表明长白瑞香提取物比乙胺嘧啶具有更好的抗弓形虫活性.研究[16-19]显示，香豆素类化合物特殊的构效关系对抗微生物活性的发挥具有重要意义，同时铁鳌合剂能有效地抑制宿主细胞游离的铁离子数量，从而有效抑制弓形虫在宿主细胞内的生长，因此上述结果可能与二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物中含有作为铁鳌合剂的香豆素类化合物(瑞香素)有关.

表1不同组别感染弓形虫前后HeLa细胞的IC50和SI

4 结论

利用长白瑞香乙醇提取物对小鼠进行急性毒性实验结果表明，长白瑞香乙醇提取物的LD50值大于10 g/(kg·BW)，对小鼠无毒，因此可对长白瑞香提取物的安全性开展进一步地临床试验.长白瑞香提取物在一定程度上可阻止弓形虫在HeLa细胞内的增殖，抑制其对细胞的破坏，其中乙酸乙酯和二氯甲烷萃取物的效果较为明显.长白瑞香提取物对弓形虫的作用机制有待于进一步研究.本文结果可为进一步开发、利用长白瑞香提供科学依据.