捕捞应激对团头鲂不同组织中Nrf2-Keap1信号通路相关基因表达的影响

赵振新， 杨明举， 张显波， 赵 凤， 杨 星， 赵 飞， 刘 伟

(1.贵州省农业科学院 水产研究所， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省特种水产工程技术中心, 贵州 贵阳 550025)

鱼类的应激反应(Stress response)是指鱼类对超过其正常生活范围的异常因素刺激所产生的一种非特异性生理反应，包括初级应激反应(血液中皮质类胆固醇和茶酚胺类物质浓度升高)和次级应激反应(代谢与机能的改变，如器官组织应激损伤，肝组织糖原含量变化等)[1]。应激反应对动物机体健康具有双重作用，过度或过长的应激对机体产生危害，适当的应激可增强机体的适应能力，不同的应激反应在生产中被分别予以预防和利用[2]。在鱼类养殖、捕捞、运输等过程中会对鱼体产生不同程度的应激作用，严重时可引起鱼类行为异常、皮肤渗透性增强、食欲下降、生殖力降低、生长受到抑制、抵抗力下降甚至死亡等[3]。如黄颡鱼运输过程中，第0～3天的皮质醇含量明显高于第7～35天，在第7天时血清皮质醇含量明显减少[4]。陈鹏飞等[5]研究拥挤胁迫对苗王云鲫的影响时发现，胁迫第3天鱼体内的皮质醇和血糖含量均达最大值，此后含量缓慢下降，30 d后维持正常水平。因此，研究鱼类应激反应特点可有效降低水产养殖过程各种应激源对鱼体生长健康和存活率的影响有重要的指导作用。

团头鲂(Megalobramaamblycephala)俗称武昌鱼，隶属硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，鮊亚科，鲂属。团头鲂是我国大宗淡水养殖鱼类之一，具有养殖成本低、生长快、规格适中、含肉率高等优点，被作为优良的淡水养殖品种在全国推广[6-7]。由于团头鲂对环境的应激比较敏感[8]，生产中捕捞、养殖密度改变等产生的应激均会严重影响其生长发育和存活率。目前关于团头鲂应激反应的研究已有诸多报道，如密度、药物应激[9-10]等，但关于捕捞应激相关研究却鲜见报道。因此，笔者等研究捕捞应激对团头鲂体内不同组织器官产生氧化应激过程中Nrf2-Keap1信号通路相关基因的表达情况，以期从机理上了解捕捞对团头鲂产生应激反应的变化情况，从而为其水产健康养殖及免疫防控技术的研究提供理论支撑。

1材料与方法

1.1材料

团头鲂由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉渔场提供，150 g左右，体质健康无伤。饲养于循环水系统中，饲料为通威股份无锡分公司颗粒饲料(粗蛋白:32%)。试验中所需的团头鲂基因全长序列NOX2、Nrf2、Keap1、Bach1、CAT和SOD从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心水产病害与饲料研究室的团头鲂基因组数据库中所得。

1.2试验设计

试验采用单因素设计。挑选12尾体量为(150±0.35)g健康充满活力的团头鲂，在室内循环水槽中饲养3周，每天投喂3次(8:20-9:00、11:30-12:10和16:50-17:30)，饱食。饲养期间循环水系统日夜连续循环并充气增氧，饲养温度(26±1)℃，pH 7.2～7.8，DO>6 mg/L，H2S<0.01 mg/L，光照周期为光照∶黑暗=14 h∶10 h。保持室内安静以避免对鱼产生惊扰应激。

采样前将鱼停食24 h，并将水槽内水深降至10 cm，迅速用抄网将鱼全部捞出，并在空气中暴露5 min后放入事先备好的MS-222(浓度为100 mg/L)中做快速深度麻醉，取鱼鳔(S-B)、肝脏(L)、肾脏(K)、肠道(I)、心脏(H)、肌肉(M)、脑(B)、脾脏(S)及头肾(H-K)等组织用液氮速冻后于-80℃保存，用于分子生物学测定。

1.3引物的设计与合成

引物根据团头鲂Nrf2、Keap1和Bach1基因序列及内参基因β-actin (GeneBank Accession No. AY170122.2)设计[11](表1)。

表1 团头鲂Nrf2、Keap1和Bach1基因荧光定量PCR引物

1.4cDNA的提取

根据杨震飞等的方法[9]，按照TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒说明书分别提取肠道、肝脏、鱼鳔等组织的总RNA，并通过电泳检测RNA的完整性，一般OD260/280为1.8～2.0。并以DNAase I处理过的RNA及RT液为模板，确定处理过的样品RNA中无DNA污染。最后，采用TaKaRa Prime Script®RT reageat Kit反转录试剂盒合成cDNA，并置于—20℃保存待用。

1.5SYBR Green I Real Time PCR反应

各组织中Nrf2、Keap1和Bach1相对表达水平的确定采用崔素丽[12]的方法。在荧光定量扩增效率一致的前提下，使用β-actin对测定的Ct值做均一化处理，以对照组中mRNA为基准，用2-ΔΔCt法获得基因相对表达量。

1.6数据处理

采用Duncan对试验数据进行多重比较，在单因素方差分析基础上利用SPSS 20.0检验各试验组数据的差异性。

2结果与分析

2.1捕捞应激团头鲂不同组织中3种基因的表达量

Nrf2-Keap1信号通路中相关基因的表达结果(图1)显示，当团头鲂受到捕捞应激后，肠道和肝脏中的氧化应激表现最激烈，Nrf2、Keap1和Bach1基因均出现极显著的表达上调。但鱼鳔、肾脏、心脏、肌肉、脑、脾脏及头肾中的基因表达量无显著变化，表明，捕捞应激反应主要集中在肝脏和肠道中。

注：不同小写字母表示不同组织间基因表达差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters indicate significance of difference in gene expression among different tissues atP<0.05 level.

图1 捕捞应激团头鲂不同组织中Nrf2 、Keap1和Bach1 基因的表达量

Fig.1 Expression ofNrf2,Keap1 andBach1 gene in different tissues ofM.amblycephalaunder rapid fishing stress

2.2捕捞应激团头鲂肝脏和肠道Nrf2-Keap1信号通路

从图2看出，在鱼体受到捕捞应激时，肝脏和肠道中的组织细胞会产生应激反应，从而激活呼吸爆发相关活性酶产生ROS，过多的ROS激活Nrf2和Keap1，促使Nrf2与Keap1分离进入细胞核，然后与细胞核中的Bach1相互作用产生细胞因子激活SOD、CAT等抗氧化酶，而抗氧化酶会消除细胞内过多的ROS，以减少捕捞应激所带来的损伤。

图2 捕捞应激团头鲂肝脏和肠道细胞中Nrf2-Keap1的信号通路

Fig.2 Signal channel of Nrf2-Keap1 in liver and intestinal cell ofM.amblycephalaunder rapid fishing stress

3结论与讨论

应激是一种反应模式，是指动物机体受到外界或内部不良因素刺激后，所产生的一系列非特异性应答反应[13-14]。但同一种刺激对机体不同组织所造成的应激反应有所不同。商振达等[15]研究得出，饥饿应激对不同部位肌肉的糖酵解指标和品质指标有不同程度的影响，其中饥饿应激对股二头肌的糖酵解指标和品质指标影响最大。YANG等[16]研究发现，高密度养殖团头鲂，其产生的应激可导致肠道产生氧化应激损伤，但对肌肉和脑却不会产生相应的伤害。研究表明，捕捞所产生的应激对肠道和肝脏产生较明显的影响，显著促进组织细胞中呼吸爆发活性，从而激活抗氧化信号通路Nrf2-Keap1中相关基因的活性，但对于脑、肾脏、肌肉等组织却无显著影响。表明，捕捞所产生的瞬时应激反应主要集中在肝脏和肠道中。

应激可直接或间接促进生物体内ROS生成，而ROS可与组织的细胞膜、蛋白质及核酸分子发生氧化还原反应，发挥杀菌作用，参与宿主细胞的免疫。在此过程中细胞质中的 NADPH 氧化酶(NOX)会转移到细胞膜，与膜上的NADPH结合产生超氧阴离子(O2-)，最后转换成ROS[17-18]。然而，过量的ROS会引发细胞的氧化损伤，阻碍生物体的生长和发育[19]。研究表明，捕捞所产生的应激反应显著促进了肝脏和肠道细胞中Nrf2、Keap1和Bach1基因的表达，说明短暂的瞬时应激已经激活了肝脏和肠道内抗氧化应激反应，从而使抗氧化系统开始发生反应，抵抗应激所带来的伤害。徐蕾[20]研究也得出，短期饥饿应激便可导致翘嘴鳜肠道发生强烈的氧化应激反应，氧化应激相关基因表达量也显著增加。邓悦[21]研究发现短暂的氧化应激可引起大鼠内耳发生氧化损伤，从而导致听觉器官损伤。

短暂的捕捞应激中，脑、肌肉、肾脏等组织中的Nrf2、Keap1和Bach1 m RNA 表达量没有出现上调，在食蚊鱼的研究中应激初期也有类似的结果[22]。在大黄鱼锌的急性氧化应激初期试验中，Nrf2-Keap1相关基因的表达量同样没有显著上调[23]。说明，捕捞所产生的应激强度较小且短暂，未对团头鲂机体整体抗氧化防御系统造成大的影响，机体处于可调节的动态平衡中。但如果持续的、高强度的捕捞应激，可能会影响抗氧化应激能力，导致机体发生氧化应激损伤，相关研究还有待进行。