不同叶龄组织库拉索芦荟对6种典型致病细菌的抑菌效果

王 斌， 张腾霄， 张春华， 赵洪波， 刘旭阳

(绥化学院 食品与制药工程学院， 黑龙江 绥化 152061)

芦荟中含有蒽醌、多糖、多肽、活性酶和有机酸等天然活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗衰老、调节免疫力、抗肿瘤等活性，广泛用于保健食品、传统医药、美容品中[1-2]。芦荟中蒽醌化合物具有较强的广谱抑菌效果，且对易产生耐药性的葡萄球菌和链球菌最敏感，有关芦荟抑菌研究主要涉及临床用药[3-13]、畜禽养殖[14-15]、大田作物栽培[16-17]、食品防腐[18-19]等。金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌和阴沟肠杆菌不但会导致畜禽疾病，而且是人类食源性致病菌，困扰着人类的健康和养殖业的发展。在食品防腐中，合成防腐剂和添加剂对人体健康存在隐患，发现和开发新型天然抗菌剂符合当前食品安全需求。芦荟生长过程中嫩叶不断从中心抽生但老叶并不凋落，相关研究表明不同叶龄的芦荟叶片中代谢积累成分不同，其功能也有所差别。目前，鲜见有关不同叶龄组织芦荟叶片功能的研究报道。为此，笔者等采用药敏纸片法和二倍稀释法，比较不同叶龄组织库拉索芦荟对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌、阴沟肠杆菌等常见致病菌的抑菌效果，以期为库拉索芦荟在医药、养殖、食品防腐等方面的深度开发提供参考依据。

1材料与方法

1.1材料

库拉索芦荟： 6年生芦荟，产于黑龙江省绥化市。经绥化学院鉴定为库拉索芦荟(AloebarbadensisMiller)。

阳性对照品：硫酸庆大霉素胶囊(重庆迪康长江制药有限公司)，氯霉素滴眼液(长春迪瑞制药有限公司)，红霉素肠溶片(江苏平光制药有限责任公司)，芦荟胶制剂(芦荟胶含量为96%，广州广德堂药业有限公司)。

革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，均购于中国工业微生物菌种保藏中心。

试剂：乙醇、蒸馏水、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖，均为分析纯。

仪器：FA2104电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，SW-CJ-2F双人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司)，YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，HPX-9162MBE数显电热培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，BCD-209KHC冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司)，KQ-50B型超声波清洗器(南京科立华仪器仪表有限公司)。

1.2方法

1.2.1培养基制备大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌培养基配方：牛肉膏 3.0 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂 20.0 g和 H2O 1 000 mL。金黄色葡萄球菌培养基配方：牛肉膏1.5 g、蛋白胨 5.0 g、NaCl 40.0 g、琼脂 10.0 g和 H2O 500 mL。阴沟肠杆菌培养基配方：牛肉膏5.0 g、蛋白胨 5.0 g、NaCl 2.5 g、琼脂 10.0 g、葡萄糖5.0 g和 H2O 500 mL。上述培养基按配方配置后分装、灭菌(121℃，20 min)、倒平板，置于超净工作台备用。

1.2.2菌悬液制备将4℃冰箱保存的6种供试菌分别转接在相应平板培养基上，37℃培养24 h。将培养好的菌落分别用接种环刮取2～3环放入装有灭菌生理盐水锥形瓶中，摇床(200 r/min)上振摇10 min得菌悬液，按麦氏比浊管法将菌悬液的菌浓度稀释调整为1×106cfu/mL，置超净工作台中备用。

1.2.3样品液制备样品共24个：样品A，嫩叶皮+凝胶；样品B，嫩叶凝胶；样品C，中叶皮+凝胶；样品D，中叶凝胶；样品E，老叶皮+凝胶；样品F，老叶凝胶。样品A～F均按浓度100%、75%、50%和25%进行配置。配置方法：分别用蒸馏水、无菌水清洗库拉索芦荟叶表面。称取其老叶(生长底部)、中叶(生长中部)、嫩叶(生长上部)的皮+凝胶及凝胶各10 g，充分研磨，得原液(浓度100%)。用无菌水稀释分别得到浓度为75%、50%、25%的样品液，置于超净工作台中用于测定抑菌活性。

1.2.4滤纸片法抑菌活性测定在超净工作台中分别用移液枪吸取0.2 mL不同菌悬液，均匀涂布于相应培养基平板上。将无菌滤纸片在样品液中浸泡0.5 h。用无菌镊子夹取滤纸片，淋掉多余液体，使滤纸片与培养基密切接触。每个培养平板均匀放置4张滤纸片。灭菌生理盐水为阴性对照，抗生素(H为红霉素、Q为硫酸庆大霉素、L为氯霉素、及Y为芦荟胶制剂)为阳性对照。芦荟胶制剂稀释成与样品液相同的4个浓度。将培养基置于37℃恒温培养箱内，培养24 h。测定其抑菌圈直径(mm)，平行3次，抑菌圈直径用均数±标准差表示。通过预试验确定，0.13 mg/mL红霉素(H)为金黄色葡萄球菌阳性对照，5 mg/mL氯霉素(L)为单增李斯特菌的阳性对照，0.8 mg/mL硫酸庆大霉素(Q)为革兰氏阴性菌阳性对照。并在此基础浓度上按75%、50%、25%稀释，滤纸片法测定各阳性对照品4个不同浓度对试验菌株的抑菌活性，筛选所需的阳性对照品所用的抗菌药品及浓度，具体操作同样品测定。

1.2.5最小抑菌浓度测定采用二倍稀释法，参照文献[15]和[20]方法测定最小抑菌浓度：将1.2.3步骤制备的芦荟样品原液以有效成分为1.0 g/mL计，用液体培养基将各芦荟样品原液(浓度100%)稀释成二倍比的系列试管，各试管浓度分别为0.50 g/mL、0.25 g/mL、0.125 g/mL、0.062 5 g/mL、0.031 3 g/mL、0.015 6 g/mL、0.007 8 g/mL、0.003 9 g/mL、0.002 0 g/mL和0.001 0 g/mL，再向各试管中加入0.1 mL含 1×106CFU/mL 的菌悬液，试管置于 37℃恒温培养 24 h，观测最小抑菌浓度(MIC)。

2结果与分析

2.1不同叶龄组织库拉索芦荟的抑菌效果

2.1.1金黄色葡萄球菌从图1可知，不同叶龄库拉索芦荟皮+凝胶部分(100%浓度)对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，且叶龄间抑菌效果接近。嫩叶皮+凝胶、中叶皮+凝胶和老叶皮+凝胶的抑菌圈直径分别是(28.1±0.53)mm、(28.2±0.53)mm、(28.4±0.53)mm，与阳性对照品0.13 mg/mL红霉素抑菌效果接近，高于芦荟胶制剂。不同叶龄库拉索芦荟凝胶部分对金黄色葡萄球菌的抑菌效果是对应叶龄其皮+凝胶的约1/3，且叶龄间差别不大。各样品抑菌活性均随样品浓度降低而降低。

2.1.2单增李斯特菌从图2可知，不同叶龄库拉索芦荟皮+凝胶(100%浓度)对单增李斯特菌的抑菌效果略高于其凝胶(100%浓度)，但差异不大。且其抑菌活性稍高于芦荟胶制剂，明显低于阳性对照5 mg/mL氯霉素。各样品对单增李斯特菌抑菌效果差异较小，其抑菌活性均随样品浓度降低而降低。

图1 不同叶龄组织库拉索芦荟对金黄色葡萄球菌的抑菌活性

Fig.1 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstS.aureus

Fig.2 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstL.monocytogenes

2.1.3大肠杆菌从图3可知，不同叶龄库拉索芦荟皮+凝胶(100%浓度)对大肠杆菌的抑菌效果最好，且叶龄间抑菌效果接近。嫩叶皮+凝胶、中叶皮+凝胶和老叶皮+凝胶的抑菌圈直径分别为(15.5±0.27)mm、(15.7±0.27)mm、(15.7±0.27)mm，与阳性对照0.8 mg/mL硫酸庆大霉素抑菌效果接近，高于芦荟胶制剂。不同叶龄库拉索芦荟凝胶对大肠杆菌的抑菌效果比其对应叶龄皮+凝胶的活性约低20%，且叶龄间差别不大。各样品抑菌活性均随着样品浓度降低而降低。

2.1.4肠炎沙门氏菌从图4可知，不同叶龄库拉索芦荟皮+凝胶(100%浓度)对肠炎沙门氏菌的抑菌效果明显高于其凝胶(100%浓度)，其抑菌活性略高于芦荟胶制剂，明显低于阳性对照0.8 mg/mL硫酸庆大霉素。同组织不同叶龄的芦荟对肠炎沙门氏菌抑菌活性无明显差异。皮+凝胶的抑菌活性均随样品浓度降低而降低。凝胶浓度100%和75%样品的抑菌活性接近，但样品浓度50%和25%无抑菌活性。

Fig.3 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstE.coli

图4 不同叶龄组织库拉索芦荟对肠炎沙门氏菌的抑菌活性

Fig.4 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstS.enteritidis

2.1.5阴沟肠杆菌从图5可知，不同叶龄库拉索芦荟皮+凝胶(100%浓度)对阴沟肠杆菌的抑菌效果略高于其凝胶(100%浓度)，但差异不大。皮+凝胶(100%浓度)的抑菌活性略高于芦荟胶制剂，明显低于阳性对照0.8 mg/mL硫酸庆大霉素。同组织不同叶龄的芦荟对阴沟肠杆菌抑菌活性无显著差异。各样品浓度100%和75%其抑菌活性接近，但所有25%浓度样品均无抑菌活性。

Fig.5 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstE.cloacae

2.2最小抑菌浓度

从表1可知，不同叶龄皮+凝胶样品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌的最小抑菌浓度分别均为0.007 8 g/mL、0.007 8 g/mL、0.062 5 g/mL和0.062 5 g/mL；不同叶龄凝胶样品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌的最小抑菌浓度分别均为0.015 6 g/mL、0.015 6 g/mL、0.250 0 g/mL和0.500 0 g/mL；各样品对阴沟肠杆菌最小抑菌浓度均为0.250 0 g/mL。说明，不同叶龄组织芦荟对供试菌的抑菌活性有差异，低浓度的芦荟样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌产生抑制作用，其最小抑菌浓度为0.007 8 g/mL。而肠炎沙门氏菌和阴沟肠杆菌对芦荟样品敏感度低，只有高浓度的样品才能发挥抑制作用。

表1 不同叶龄组织库拉索芦荟样品对供试菌的最小抑菌浓度

Table 1 MIC ofA.barbadensistissue with different leaf age against tested bacteria

样品编号Sample No.菌种 Bacteria最小抑菌浓度/(g/mL)MICA金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.007 8单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.062 5大肠杆菌(Escherichia coli)0.007 8肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)0.062 5阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)0.250 0B金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.015 6单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.250 0大肠杆菌(Escherichia coli)0.015 6肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)0.500 0阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)0.250 0C金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.007 8单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.062 5大肠杆菌(Escherichia coli)0.007 8肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)0.062 5阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)0.250 0D金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.015 6单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.250 0大肠杆菌(Escherichia coli)0.015 6肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)0.500 0阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)0.250 0E金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.007 8单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.062 5大肠杆菌(Escherichia coli)0.007 8肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)0.062 5阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)0.250 0F金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.015 6单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.250 0大肠杆菌(Escherichia coli)0.015 6肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)0.500 0阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)0.250 0

3结论与讨论

库拉索芦荟样品对供试菌有明显的选择抑制性，不同叶龄库拉索芦荟皮+凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，不同叶龄间抑菌活性接近，且最小抑菌浓度均为0.007 8 g/mL，样品液(100%浓度)与阳性对照0.13 mg/mL红霉素相近，优于阳性对照芦荟胶制剂，可能是芦荟胶制剂中加入了维生素E及其他辅料从而降低了其抑菌效果。不同叶龄库拉索芦荟凝胶对大肠杆菌的抑菌效果最好，不同叶龄间抑菌活性接近，最小抑菌浓度均为0.007 8 g/mL，样品液(100%浓度)抑菌效果略小于阳性对照0.8 mg/mL硫酸庆大霉素，与阳性对照芦荟胶制剂相近。建议在开发抑制金黄色葡萄球菌的应用时，结合生物学产量，选用中叶库拉索芦荟皮+凝胶；抑制大肠杆菌时，选用中叶库拉索芦荟凝胶。

研究表明，浓度大于50%的库拉索芦荟样品对5种致病菌均有显著的抑制作用，且浓度越高抑菌效果越好；皮加凝胶的抑菌效果明显优于凝胶的抑菌效果，但库拉索芦荟老叶、中叶、嫩叶的抑菌作用无显著差别。同种芦荟样品对各种病菌抑制作用表现出选择性差异，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制效果较突出，尤其是皮加凝胶原液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌圈直径均接近其对应阳性对照(红霉素和硫酸庆大霉素)。库拉索芦荟皮+凝胶抑菌效果依次为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>肠炎沙门氏菌>单增李斯特菌>阴沟肠杆菌。库拉索芦荟凝胶抑菌效果依次为大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>阴沟肠杆菌>单增李斯特菌>肠炎沙门氏菌。

蒽醌类化合物和凝胶多糖是芦荟发挥抗菌作用的有效成分，且蒽醌类化合物的抗菌活性大于凝胶多糖由于蒽醌类化合物主要积累于芦荟外皮中[21-23]，因此，同叶龄库拉索芦荟皮+凝胶的抑菌效果明显优于凝胶的抑菌效果。

库拉索芦荟的外皮和凝胶均有优良的抗菌作用且抗菌谱广。从叶龄看，库拉索芦荟老叶、中叶、嫩叶抑菌效果无显著差别。从组织看，同叶龄库拉索芦荟皮+凝胶的抑菌效果明显优于凝胶的抑菌效果，二者对铜绿假单胞菌均无抑菌效果。从抑菌敏感度看，库拉索芦荟皮+凝胶对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，凝胶对大肠杆菌的抑菌效果最强。说明，库拉索芦荟成为新型天然抗菌剂的潜力巨大。