白内障晶状体上皮细胞中miR-126和caspase-3的表达关系及意义

程丽娜 闫春妮 宋蔚

白内障是由遗传、免疫及外部伤害等其他先天性或后天性因素导致的一种眼部疾病。临床主要表现为单侧或双侧、晶状体浑浊、视物不清晰等，常发生于40岁以上人群，发病率随年龄增大而升高。据报道全球因白内障致盲的人数占40%以上[1]，其中约一半病例发生在亚洲等发展中国家，视力损害给患者生活造成极大不便，但白内障发病机制至今尚未完全明确。因此，不断寻找有效的诊断指标，探求白内障的发病机理对病情防治十分重要。研究表明白内障发病的首要环节是晶状体上皮细胞凋亡，现今已发现miR-125、miR-181及miR-126等多种miRNA能够通过调控人晶状体上皮细胞凋亡，影响白内障进程[2]，caspase-3是与细胞凋亡有关的调节因子，其表达量一定程度上可以反映出凋亡发生情况[3]。笔者查阅发现对于miR-126与caspase-3在白内障疾病中作用及二者与晶状体上皮细胞凋亡的关系鲜有报道。本研究拟通过检测白内障晶状体上皮细胞中miR-126、caspase-3表达情况，分析二者与白内障患者晶状体上皮细胞凋亡的联系，旨在探讨二者在白内障疾病发生中作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年5月至2018年6月本院收治的78例白内障患者为观察组，其中男37例43眼，女41例46眼；年龄45～76岁，平均年龄(61.24±5.36)岁；同期选取52例正常人(角膜移植术供体)为对照组，男24例24眼，女28例28眼；年龄45～75岁，平均年龄(60.12±4.95)岁。2组研究对象一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准 白内障患者纳入标准：(1)经确诊符合白内障诊断标准[4]；(2)患者均对本研究知情，并签署知情同意书；(3)角膜散光<1.00D。排除标准：(1)合并青光眼、视神经炎及其他眼底疾病；(2)合并高血压、糖尿病及其他继发性视力减退疾病；(3)自身免疫疾病、精神疾病及感染性疾病。

1.3 主要试剂及仪器 RNA提取试剂盒：购自于赛默飞世尔科技公司；SYBR®Green Kit：购自上海翊圣生物科技有限公司；引物：由南京科佰生物科技有限公司合成；多功能酶标仪、qRT-PCR仪：购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪：购自艾森生物科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 样品采集与保存:采用超声乳化白内障吸除术，收集患者晶状体上皮细胞样本，培养于DMEM细胞培养液中，置于37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中培养48 h。

1.4.2 晶状体上皮细胞中miR-126、caspase-3水平:收集晶状体上皮细胞，采用RNA提取试剂盒提取晶状体上皮细胞中总RNA，反转录得cDNA。采用定量PCR仪分别对miR-126、caspase-3进行扩增。qRT-PCR分别采用SYBR®Green Kit试剂盒，反应体系均为10 μl，具体步骤参见说明书；miR-126反应条件：95℃：40 s；95℃：10 s；55℃：30 s，共40Cyc；caspase-3反应条件：94℃：30 s；55℃：45 s；72℃：45 s，共30Cyc。miR-126及内参U6、caspase-3及内参β-actin的引物序列见下表。采用2-ΔΔCT法对miR-126、caspase-3表达水平进行定量分析。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 晶状体上皮细胞中caspase-3蛋白表达水平:Western blotting法测定晶状体上皮细胞中caspase-3蛋白表达水平，加入裂解液静置40 min后，12 000 r/min离心30 min，取上清，进行SDS-PAGE电泳，再转移至PVDF薄膜上，加入一抗(anti-caspase-3)4℃孵育过夜，加入HRP标记的IgG二抗稀释液室温孵育2 h后，以β-actin为内参，进行拍照并计算caspase-3/β-actin值。每个样品测定3次，取平均数。

1.4.4 晶状体上皮细胞凋亡率的测定:使用胰蛋白酶处理各样本培养细胞，磷酸缓冲液洗涤后，离心10 min(2 000 r/min)，弃上清，将细胞浓度调至100 000/ml，滴加双染剂静置20 min后，转至冰上，分别加500 μl结合缓冲液，混合均匀，放入流式细胞仪中进行检测。

2 结果

2.1 晶状体上皮细胞中miR-126、caspase-3 mRNA水平比较 观察组患者晶状体上皮细胞中miR-126水平显著高于对照组，caspase-3 mRNA水平显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 正常对照组及观察组晶状体上皮细胞中miR-126、Caspase-3 mRNA水平比较

2.2 晶状体上皮细胞中caspase-3蛋白水平比较 观察组白内障患者晶状体上皮细胞caspase-3蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。见图1，表3。

图1 Western印迹观察晶状体上皮细胞中caspase-3蛋白表达情况

2.3 晶状体上皮细胞凋亡率比较 观察组白内障患者晶状体上皮细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。见表4。

表3 正常对照组及观察组晶状体上皮细胞中caspase-3蛋白水平比较

表4 正常对照组及白内障观察组晶状体上皮细胞凋亡率比较

2.4 白内障患者晶状体上皮细胞中miR-126、caspase-3表达与晶状体上皮细胞凋亡率的相关性 白内障患者晶状体上皮细胞中miR-126、caspase-3表达与晶状体上皮细胞凋亡率均呈显著正相关(r=0.669，P<0.05；r=0.633，P<0.05)。见图2、3。

图2 白内障患者晶状体上皮细胞中miR-126表达及其凋亡率的相关性分析

图3 白内障患者晶状体上皮细胞中caspase-3表达及其凋亡率的相关性分析

2.5 白内障患者晶状体上皮细胞中miR-126、caspase-3表达的相关性 白内障患者晶状体上皮细胞中miR-126水平与caspase-3表达水平显著正相关(r=0.599，P<0.05)。见图4。

图4 白内障患者晶状体上皮细胞中miR-126与caspase-3表达的相关性分析

3 讨论

白内障是晶状体衰老造成的，晶状体是眼内一个无血管组织，具有屈光作用，能够使眼球视物的焦点落到视网膜上。晶状体由晶状体囊及晶状体纤维组成，在晶状体与晶状体囊之间有一单层上皮细胞即晶状体上皮细胞，能够分化成为晶状体纤维，是晶状体代谢活跃的细胞，上皮细胞的活性对晶状体生长、分化、维持晶状体的透明性及修复损伤有着至关重要的作用。研究表明，外部损伤、年龄老化及免疫代谢等均会使晶状体上皮细胞活性降低，抗氧化能力下降，晶状体内自由基含量随之上升，使得晶状体受到氧化损伤，影响晶状体的正常代谢及其他生理功能，导致晶状体浑浊，引发白内障，但其具体机制仍未明确[5]。随着白内障患病率逐年上升，尤其在亚洲等发展中国家现象更为明显，给社会造成极大负担，因此探寻白内障发病机制，对诊断白内障疾病进程具有重要意义。

微小RNA(miRNA)是一类单链小分子非编码RNA，具有负性调节靶基因的功能[6]。研究表明，miRNAs在眼部功能方面具有重要调控作用，影响晶状体细胞增殖、分化、衰老等过程，与白内障等疾病进程密切相关[7]。已报道的miRNAs有miR-34、miR-125、miR-181、miR-184及miR-126等。季青山等[8]探究了miR-34a/SIRT1在H2O2诱导人晶状体上皮细胞氧化应激中的表达情况，结果发现细胞氧化应激损伤可引起miR-34a表达水平上调，SIRT1表达水平下调。孙根柱等[9]研究表明miR-125a-3p在晶状体上皮细胞凋亡中表达是下调的。可能与白内障的发病机制有关。秦宇等[10]探讨了miR-181调控白内障晶状体上皮细胞凋亡机制，结果表明miR-181能促进晶状体上皮细胞凋亡，可能为白内障非手术治疗提供新途径。丁芝祥等[11]研究发现TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞转分化时，细胞内miR-184表达上调，且表达水平与诱导浓度及时间有关。汪静[12]探究了miR-126表达水平对人晶状体上皮细胞凋亡的影响，结果发现miR-126可能通过调控HLEB3凋亡，从而在白内障治疗中发挥作用。与过往研究一致的是，本研究结果发现白内障患者晶状体上皮细胞中miR-126水平表达量较正常人显著上调，提示miR-126可能与白内障的发病相关。

目前研究认为，白内障发病的首要环节是晶状体上皮细胞凋亡，晶状体上皮细胞是晶状体内代谢最活跃的部位，它的凋亡会导致晶状体上皮细胞密度降低，从而使晶状体的正常生长受到影响[13]。此外晶状体上皮细胞内含有大量酶系统，具有抗晶状体氧化损伤、维持内环境稳定的作用。因此，晶状体上皮细胞对于维持晶状体透明十分重要。本研究发现，白内障患者晶状体上皮细胞凋亡率高于正常人，提示晶状体上皮细胞凋亡率可能与白内障疾病的发展相关。caspase-3是caspases半胱氨酸蛋白酶家族中的一员，又叫“杀手蛋白”，近年来研究人员发现caspase-3是细胞凋亡发生过程中的终末蛋白，在细胞凋亡中起着关键的作用，细胞经紫外线等物理、化学因素刺激后，caspase-3被激活，可使细胞中的细胞骨架等蛋白质成分降解，从而发生细胞凋亡[14]。研究表明，caspase-3能够降解晶状体连接蛋白，提示caspase-3的表达可能参与了白内障的形成[15]。郑华峰等[16]研究了miR-126在大鼠心肌缺血再灌注早期的表达及作用，结果发现miR-126的与caspase-3的激活有关，从而影响了缺血心肌细胞的凋亡。Li等[17]研究发现caspase-3与TUG1均为miR-421的直接靶标，通过miR-421/caspase-3靶向调节晶状体上皮细胞凋亡。这与本实验有着相似之处，本研究结果发现观察组晶状体上皮细胞中caspase-3 mRNA和蛋白水平均显著高于对照组，与李延辉等[18]人对于老年性白内障状体上皮细胞凋亡及Caspase-3的表达情况研究一致，提示晶状体上皮细胞凋亡及caspase-3的表达与白内障的发病机制有关。进一步分析显示，白内障患者晶状体上皮细胞中miR-126、caspase-3水平与细胞凋亡率显著正相关，miR-126水平与caspase-3表达水平亦呈显著正相关。提示miR-126与caspase-3可能通过某种机制共同参与调节晶状体上皮细胞凋亡，进而影响白内障疾病的发生及发展。

综上所述miR-126、caspase-3在白内障晶状体上皮细胞中高表达，与晶状体上皮细胞凋亡有关，提示二者可能通过调节晶状体上皮细胞凋亡过程，参与白内障发病过程调控。