斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry转基因模型的构建

林春雨，郏建新，康琪，吴志强，李明玉

(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003；2.厦门大学药学院，福建厦门361102)

糖尿病是一种复杂的代谢性紊乱疾病，主要表现为体内血糖调节失衡导致的高血糖症状，持续的高血糖导致的血管、心脏、眼睛、肾脏和神经受损等并发症[1-2]。体内血糖主要受α细胞分泌的胰高血糖素和β细胞分泌的胰岛素来共同调节。虽然1型和2型糖尿病的核心机制都是由于胰岛β细胞的破坏和功能不足导致胰岛素的绝对和相对缺乏[3-4]。但近年来研究发现，胰岛α细胞在血糖稳态调节和糖尿病发病机制中起重要的调控作用，这使有关α细胞研究越来越受到关注[5]。胰高血糖素主要的功能是在禁食的状态下控制血糖水平，刺激肝糖产生为机体提供的葡萄糖，其浓度受到血糖水平的负性调控，若在血糖升高的情况下能够有效地抑制胰高血糖素的分泌或者阻断胰高血糖素受体信号通路，即可起到降低血糖的作用，因此针对其信号通路作为靶点也成为开发新型抗糖尿病药物的热点[6-7]。因为α细胞的功能和发育都与糖尿病的发生和发展息息相关，如能够在动物模型上实现对胰岛α细胞的定性、定量分析及对其活性功能进行示踪，将给α细胞的相关研究提供强有力的工具。

作为一种新型的脊椎动物模式生物，斑马鱼具有众多优点，特别是可利用荧光蛋白对特定细胞实现可视化的活体示踪[8-9]。另外，斑马鱼的胰岛在解剖学、形态学上以及生理调控上都和哺乳动物非常相似[10]。更重要的是，斑马鱼在胰岛α-细胞和β-细胞发育过程中关键的信号分子和信号通路都与哺乳动物基本一致，因此斑马鱼是进行糖尿病疾病机理及药物筛选的良好模式动物[11-13]。

虽然目前，已经有胰岛α细胞表达的GFP转基因鱼Tg(gcga：GFP)[14]，但由于其全细胞表达GFP，在活体分析其细胞功能时，分辨率不高，容易造成数据的偏差；且其不能同其他表达GFP的转基因鱼进行双荧光分析，造成了其局限性。因此，为了获得高分辨率和提供更多分析斑马鱼胰岛α细胞的工具，本文构建了胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry的新型转基因斑马鱼Tg(-2.8gcga：H2bmCherry)。

1 实验材料

1.1 仪器 Eps 200电泳仪(Tanon公司)；超净台(香港力康生物医疗科技有限公司)；微波炉(西门子电器有限公司)；水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；鱼卵培养箱(韶光市泰宏器械有限公司)；细菌培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；电子天平(舜宇恒平仪器)；M165FC体式荧光显微镜(莱卡公司)；Axio Imager AI正置荧光显微镜(蔡司公司)；SP8共聚焦显微镜(莱卡公司)；小型离心机(Kylin Bell公司)；PCR仪(德国Eppendorf公司)；UPV凝胶成像仪(上海复日科技有限公司)。

1.2 实验试剂 DNA高保真聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，批号：AP131-11)；限制性核酸内切酶：Age-I、Kpn-I(NEB 公司)； In-Fusion HD Cloning Kit(Takara公司)；胶红(Gel stain，上海翊圣生物科技有限公司)；胶回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：B515103-0100]；DNA Marker(Tarkara公司)；多聚甲醛[PFA paraformaldehyde，生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：D606BA0003]；琼脂糖[生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：A501004]；小鼠单克隆 antiglucagon抗体(Sigma公司，批号：MABN238)；FITC标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(Jackson公司，批号：115-095-003)。

1.3 实验动物 野生型斑马鱼(AB)；Tg(gcga：GFP)转基因斑马鱼；Tg(-2.8gcga：H2bmCherry)转基因斑马鱼。条件及产卵方式按照以下实验方法进行。

2 实验方法

2.1 实验动物-斑马鱼的养殖 斑马鱼的饲养是按照标准的饲养方法：每天3次投喂颗粒饲料，早晚各喂养1次丰年虫卵，并给予适宜的光照(光照 ∶黑暗＝14∶10)和温度(25℃)，并利用碱泵和盐泵调节适宜的pH(pH为7左右)和电导率(电导率为500左右)进行培养。

2.2 重组质粒的构建 本实验使用In-fusion试剂盒(Clontech，货号：638912)进行重组质粒pIBS-2.8 gcga：H2bmcherry的构建。首先，利用限制性核酸内切酶(Age-I和Kpn-I)对实验室已有质粒(pIBS-2.8gcga：H2beGFP，未发表)进行酶切，胶回收后获得含有斑马鱼胰高血糖素启动子的线性化载体。然后，设计引物 H2b-F1：5′-GGAAGACTCAGCTGACCGGTATGCCAGAGCCAGCGAAGTCT-3和H2b-R1：5′-GAACAAAAGCTGGGTACCAAAAA ACCTCCCACACCTCCCCCTG-3′，正向引物添加了Age-I酶切位点，反向引物添加了Kpn-I酶切位点。利用这对引物，用高保真酶进行PCR扩增的方法从实验室已有质粒p-1.2Ins：H2Bmcherry获得 H2bmcherry-SV40polyA片段，扩增的条件为：94℃ 30 sec、60℃30 sec、72 ℃ 90 sec，35个循环。

最后，将线性化载体与目的片段按一定比例混匀，加入2μL In-Fusion HD Enzyme Premix并用水补至10μL，50℃孵育15 min后取5μL加入50μL感受态(DH5α)内做转化，菌落PCR后挑取阳性单克隆，用生工质粒小提试剂盒(批号：B515103-0100)抽提质粒。质粒进行测序并用EcoR-I和Kpn-I进行酶切验证。经过比对后，质粒的测序结果和酶切片段大小与预期结果一致，因此判断该重组质粒构建完成。

2.3 显微注射及转基因品系的筛选 野生型斑马鱼(AB)按一雄两雌的比例提前一晚放至配鱼盒内并用隔板将雌雄分开。显微注射前拔出隔板，使其自由交配产卵。先前抽提的质粒用生工SanPrep核酸纯化套件(批号：B515104-0100)进行纯化。然后，按照 I-SceI(R0694S，NEB)0.2 units·μL-1；DNA：50 ng·μL-1；1×NEB buffer2：0.5×的比例将重组质粒配制成显微注射体系，于1-细胞期注入斑马鱼胚胎的细胞质中。注射后的胚胎置于恒温培养箱孵育5 d，后经体视荧光显微镜下挑选胰岛处有红色荧光的个体(F0代)。3个月后将性成熟的F0代与AB系的斑马鱼进行杂交，然后进行荧光筛选，挑出能够稳定表达转基因特性的幼鱼(F1代)，待F1代性成熟后，便可进行后续实验。

2.4 斑马鱼幼鱼胰岛成像及免疫荧光染色 斑马鱼幼鱼胰岛成像：受精后5 d的转基因斑马鱼Tg(-2.8gcga：H2bmCherry)幼鱼在4℃条件下用4%多聚甲醛(PFA)中固定过夜，然后将其排列于载玻片上并用盖玻片将幼鱼身体压扁，以便暴露出胰岛部分。本实验成像胰岛采用的是Leica SP8倒置共聚焦显微镜，所有照片均在63×物镜下拍摄。后期处理软件为Image J和Photoshop。

免疫荧光染色：转基因斑马鱼Tg(-2.8gcga：H2bmCherry)幼鱼的免疫荧光染色参照已有的方法进行[15]。一抗小鼠单克隆anti-glucagon抗体(批号：MABN238，Sigma公司)稀释比例为 1 ∶1 000，FITC标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗稀释比例为1∶5 000。

3 实验结果

3.1 转基因表达载体的构建 该转基因表达载体pIBS-2.8gcga：H2bmCherry的构建过程及结构见(见图1)。首先，利用限制性核酸内切酶Age-I和Kpn-I对质粒pIBS-2.8gcga：H2beGFP进行酶切，以除去H2beGFP-SV40polyA片段获得含有胰高血糖素启动子的线性化载体pIBS-2.8gcga。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳可以看到大小分别为5 728 bp(pIBS-2.8gcga)和1 380 bp的两个条带，由于跑胶的原因，条带有略微上移(见图2A)。与此同时，利用上述引物H2b-F1和H2b-R1，以质粒 p-1.2Ins：H2bmCherry为模板，PCR扩增获得 H2bmCherry-SV40polyA片段，PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳后可以看到大小为1 355 bp单一的目的条带(见图2A)。分别胶回收上述5 728 bp和1 355 bp目的条带后，利用In-fusion试剂盒对获得的H2bmCherry-SV40polyA片段和pIBS-2.8gcga载体进行重组，并获得pIBS-2.8gcga：H2bmCherry质粒。获得的重组质粒经Kpn-I和EcoR-I酶切和琼脂糖凝胶电泳，可见5 922 bp和1 125 bp的两条条带，与预期一致(见图2B)。最后我们通过测序再次验证了我们获得的pIBS-2.8gcga：H2bmCherry质粒的正确性，因此我们成功构建了该载体(见图2C)。

3.2 转基因斑马鱼系的建立 我们先提取并纯化了pIBS-2.8gcga：H2bmCherry质粒。因该质粒含有归位内切酶(Meganucleases)I-SceI的识别位点，我们配制含有pIBS-2.8gcga：H2bmCherry质粒和 ISceI内切酶的混合溶液注射至野生型斑马鱼(AB)1-细胞期胚胎的细胞中，经过I-SceI的切割和重组将-2.8gcga：H2bmCherry随机整合到斑马鱼染色体中。胚胎在培养箱内孵育 5 d后，利用 Leica M165FC体式荧光显微镜进行筛选，挑出胰岛处有表达有mCherry红色荧光的转基因幼苗，置于斑马鱼培养系统中培养至性成熟(F0代)。然后将F0代与野生型斑马鱼(AB)杂交，所产生的幼鱼经筛选后，我们获得了能够稳定遗传的转基因斑马鱼品系Tg(-2.8gcga：H2Bmcherry)F1代。我们对所获得的Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)斑马鱼进行了共聚焦成像，结果表明，该品系中，胰岛α细胞非常清晰地表达了红色荧光蛋白mCherry(见图3A)。同时我们也把我们获得的品系与现有的Tg(gcga：GFP)进行了比较分析，发现我们构建胰岛α细胞核表达的mCherry清晰度明显比胰岛α细胞全细胞表达GFP高，且不同α细胞间轮廓界限明显，可很好地对α细胞进行定量和示踪分析(见图3)。

3.3 转基因系的鉴定分析 为了进一步检测我们所获得的Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)转基因斑马鱼品系其mCherry荧光特异性表达在胰岛α细胞中，我们采用了斑马鱼幼鱼免疫荧光染色的方法，受精后5 d(5 dpf)的斑马鱼幼鱼用胰高血糖素抗体及荧光二抗进行染色。结果显示，Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)胰岛α细胞的红色荧光位于细胞核中，而胰高血糖素抗体所标记的绿色荧光与胰高血糖素的原位表达一致，主要在细胞质中(见图4A和4B)。图片合并后，红色荧光标记的细胞与胰高血糖素抗体所标记的阳性α细胞完全重合，说明我们所构建的Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)转基因品系能够正确地使所有斑马鱼胰岛α细胞带上红色荧光，并真实地反映出α细胞在斑马鱼胰岛内的分布状态(见图4C)。

4 分析与讨论

作为糖尿病研究的重要器官，胰腺的发育是研究的重点，与哺乳动物一致，斑马鱼的胰腺由两个分泌室组成。外分泌室由导管和腺泡细胞组成，来自腺泡细胞的分泌酶可以通过导管转运到全身，并参与消化系统。内分泌室由胰岛组成，而胰岛包含了α、β、δ、ε和PP细胞，分别表达分泌胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、生长素释放肽和胰多肽[16-17]。斑马鱼胰岛的基本组成与人类非常相似，二者在胰岛形成机制和信号通路的研究中存在高度的保守性[13]。

虽然之前Argenton实验室构建了胰岛α细胞特异表达GFP的转基因鱼Tg(gcga：GFP)[14]，但其清晰度不高，给我们拟开展的一些精确实验分析造成了一定的难度及实验数据的偏差；且其不能同其他表达GFP的转基因鱼进行双荧光分析，造成了其局限性。本文利用胰高血糖素启动子驱动组蛋白H2b融合mCherry报告体表达的转基因方法，构建了胰高血糖素稳定遗传系转基因斑马鱼Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)。该品系能清晰地将mCherry特异表达在斑马鱼胰岛α细胞细胞核中，其分辨率和细胞间的轮廓比Tg(gcga：GFP)有明显的提高。我们进一步通过荧光免疫染色分析确认了该品系能准确标记所有的斑马鱼胰岛α细胞。至此，我们成功构建了胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry的转基因鱼。

研究表明1型糖尿病和2型糖尿病的最终发病都会引起胰岛β-细胞量的减少或者功能损伤，从而降低胰岛素的分泌。同时，还伴随着胰岛α-细胞的功能变化和由此而带来的胰高血糖素升高。在糖尿病中，α-细胞的功能变化和胰高血糖素的升高是除了高血糖、胰岛素抵抗之外的又一表现[18]。由于α细胞的功能在糖尿病的发生发展中起到重要的作用，因此近年来对于胰岛α细胞在血糖稳态调节和糖尿病发病机制中作用的研究越来越受到关注[19]。而本研究所成功构建的胰岛α细胞细胞核表达mCherry转基因斑马鱼Tg(-2.8gcga：H2BmCherry)，可利用斑马鱼胚胎透明可视化的优势，对胰岛α细胞起源、发育、分化等情况进行示踪和定量分析，对于探索胰岛α细胞功能的研究提供了一个便捷又直观的新型遗传学动物模型。同时该品系还可以用于相关的药物筛选，为糖尿病的药物开发开启更多的可能性。