茵连痛风颗粒中黄嘌呤氧化酶抑制剂的虚拟筛选

韩慧璞，徐志立，李莉，王月丹，初明，张明波

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600；2.北京大学医学部基础医学院，北京100191)

痛风是一种以持续性高尿酸血症导致尿酸钠晶体在关节及其周围组织沉积为特征的嘌呤代谢性疾病[1]。痛风与嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，可诱发高血压、高血脂、动脉粥样硬化、肥胖、胰岛素抵抗等多种疾病，对人类的健康构成很大威胁[2]。黄嘌呤氧化酶(XOD)能催化人体中尿酸的形成，是治疗高尿酸血症或痛风药物的关键靶点[3]。XOD抑制剂作为抗痛风药物，目前临床上可用的只有别嘌呤醇和非布司他[3]，二者都具有一定的副作用并且发生率高。例如，在服用别嘌呤醇后，患者有皮肤过敏、肝炎、超敏反应综合征，甚至肝功能损害等副作用[4]。非布司他最常见的副作用为肝功能异常、恶心、皮疹和关节痛[5]。因此，研究新的高效低毒的XOD抑制剂具有十分重要的理论意义和实际应用前景。

茵连痛风颗粒为上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院的自制复方制剂，由茵陈、连钱草、伸筋草组成，具有清热、利湿、通络的功效，用于治疗慢性痛风性关节炎。动物实验研究结果表明茵连痛风颗粒浸膏粉能够有效抑制尿酸生成，促进尿酸代谢，对痛风性关节炎具有良好的防治作用[6]。刘静等[7]通过大鼠痛风模型确定了茵连痛风颗粒中降尿酸的活性部位为黄酮、有机酸和生物碱类成分，但是具体的活性单体仍不是很清楚。

本论文运用分子对接方法，以XOD为靶点对茵连痛风颗粒中所含的化学成分进行了筛选，明确了其中对XOD具有抑制作用的活性成分，并对部分代表性成分与XOD的作用模式进行分析，为理解茵连痛风颗粒治疗痛风的作用机制及其作为抗痛风药物进一步开发奠定了基础。

1 理论与计算方法

从中药成分数据库(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[8]下载茵连痛风颗粒3味中药所含175种化合物的结构文件。利用AutoDock Tool软件进行处理，把化合物结构由Mol2格式转成AutoDock Vina[9]软件所需的pdbqt格式，建立可供筛选的化合物数据库。

从蛋白质数据库(www.rcsb.org)下载得到XOD的晶体结构(编号：1N5X)。利用ADT软件对晶体结构进行处理，去掉所含的结晶水，然后为XOD结构添加极性氢原子和原子电荷。根据晶体中原配体的位置确定对接位点的中心坐标为(96.68Å、55.72 Å、40.77Å)，3个维度的边长均为30Å。分子对接使用AutoDock Vina软件完成。在对接过程中，只改变配体的构象，而保持XOD的构象不变。选择与XOD结合能最低的构象作为化合物最终的对接结果。抑制常数可根据公式Ki＝exp[△G×1000/(Rcal×T)]换算得到，其中 T＝298 K，Rcal＝1.987 19 cal·(mol·K)-1。除特别声明外，其余所有参数均采用默认值。

2 结果

2.1 对接方法的检验 为了检验对接方法的可靠性，我们把晶体结构(编号：1N5X)中原有配体(非布司他)与空的XOD晶体结构进行对接，比较对接的构象和原晶体结构中配体构象的差异，结果如图1所示。从图1中可以看出，AutoDock Vina所预测的结合构象与原配体构象基本吻合，只在分子末端的异丙基构象稍有所差异。两个构象的均方根偏差(RMSD)只有0.91Å，说明我们所采用的对接方法能够准确预测分子的结合构象。

2.2 分子对接结果 分子对接结果表明原配体(非布司他)与XOD的结合能为-9.6 kcal·mol-1。以非布司他为阳性参照物，我们仅列出了结合能在-9.0 kcal·mol-1以下的化合物的结合能及其抑制常数，如表1所示。从化合物的种类分布来看，我们所筛选出的化合物除了迷迭香酸为酚酸外，其余均为黄酮类、类黄酮类物质及其衍生物。动物实验研究结果表明痛风颗粒中降尿酸的活性部位为黄酮、有机酸和生物碱类成分[7]。这与我们的对接计算结果基本相符。从化合物的来源来看，其中13个化合物中有9个来自连钱草，3个来自茵陈，而来自伸筋草中的只有1个。由此可见，在茵连痛风颗粒中对XOD具有抑制作用的成分主要来自连钱草。

表1 茵连痛风颗粒中单体成分与黄嘌呤氧化酶结合能△G及抑制常数Ki

2.3 活性化合物的结合模式分析 为了进一步明确这些活性成分与XOD的具体结合模式，我们对非布司他和3个代表性化合物，即木犀草素、木犀草苷和迷迭香酸与XOD的结合构象，进行了比较分析(见图2)。晶体结构表明非布司他中的羧基可以与XOD中的ARG880和THR1010形成氢键，同时非布司他中的噻唑环可以与XOD中PHE914和PHE1009形成-相互作用。非布司他中的苯基和末端的烷氧基则与 XOD中的 LEU014、VAL1011、LEU873、LEU648和PHE649等疏水性残基形成疏水相互作用。根据分子对接结果，我们发现木犀草素、木犀草苷、迷迭香酸与XOD的结合模式与非布司他的十分相似，都是结合在活性位点的疏水区。3个化合物所含有的邻苯二羟基片段，其作用与非布司他中的噻唑环相当。邻苯二羟基结构中的苯环PHE914和PHE1009形成-相互作用，其中的两个酚羟基则可以分别与ARG880和THR1010形成氢键相互作用。木犀草素和木犀草苷中苯并吡喃片段作用和非布司他中的苯基相类似，可以与周围的疏水性残基形成疏水相互作用。除此之外，木犀草素中的羰基可以和XOD中SER876形成氢键相互作用，而木犀草苷则通过其糖基中的羟基与SER876形成氢键。所以从相互作用的位点数来看，木犀草素与木犀草苷与XOD结合能力基本相当。木犀草苷中亲水性糖基的存在，使其在与XOD结合时需要较高的去溶剂化能。这可能是其活性比木犀草素弱的主要原因。迷迭香酸中不具有苯并吡喃这样的疏水片段，因此和黄酮类化合物相比疏水作用弱一些，但相应位置上的羧基可以与XOD中的GLU802和ASN768形成氢键相互作用。同时，迷迭香酸末端的邻苯二羟基片段中的苯环可以与PHE649形成p-p相互作用，其中的酚羟基还可与LEU648形成氢键相互作用。因此，迷迭香酸对XOD也具有一定的抑制能力。

3 讨论

茵连痛风颗粒在临床上对于痛风疾病的治疗具有很好的疗效，而且副作用小，适合长期服用。但是由于成分复杂，分离纯化难度大，对于其药效成分的研究只能停留在有效部位的层次上，而无法给出具体的活性单体[7]。基于分子对接的药物虚拟筛选方法是依据化合物与药物靶标的结合强度来预测药物活性。由于该方法不需要预先得到纯的单体成分，因此在中药活性成分的预测和筛选上具有广泛的应用[10]。

本论文利用虚拟筛选方法对茵连痛风颗粒所含的化合物进行了筛选。结果表明茵连痛风颗粒中有13种化合物对黄嘌呤氧化酶具有较强的抑制作用。根据我们的预测，槲皮素对XOD的抑制常数为0.91 μmol·L-1。这与Nagao等[11]的实验研究结果(0.28 μmol·L-1)基本一致。迷迭香酸和木犀草素对XOD的抑制作用，也分别有实验研究报道[12-13]。对接结果表明黄酮类苷元(木犀草素)活性要强于其糖苷(木犀草苷)，这也与既有的实验结果相一致[14]。所预测的13个活性成分中有9个来自连钱草，说明连钱草在抑制XOD的过程中发挥主要作用。从化合物结构来看，多数活性成分为黄酮类物质。进一步的作用模式分析表明，这些活性成分可分别通过p-p相互作用、疏水相互作用和氢键相互作用与XOD相结合。我们的研究结果表明直接抑制黄嘌呤氧化酶从而降低尿素的生成是茵连痛风颗粒治疗痛风的可能机制之一。这为茵连痛风颗粒治疗痛风的临床应用和进一步开发提供一定的理论指导。