重金属耦合剂（乙二胺四乙酸和柠檬酸钠）与抗氧化剂（硫辛酸和乙酰肉碱）对小鼠卵子数目、线粒体的影响

马天仲 牛艳茹 韦冰

【摘要】 目的：探討分析小鼠卵子数目和线粒体活性受重金属耦合剂（乙二胺四乙酸和柠檬酸钠）与抗氧化剂（硫辛酸和乙酰肉碱）的影响。方法：研究对象选定为148只G57BL/6雌性小鼠，因在饲养期间发生互咬等正常死亡，最终参加实验的小鼠共144只。依据随机分组方式将144只小鼠为四组，每组各36只。使用重金属耦合剂（乙二胺四乙酸和柠檬酸钠）的小鼠为重金属组，使用抗氧化剂（硫辛酸和乙酰肉碱）的小鼠为抗氧化组，使用重金属耦合剂与抗氧化剂小鼠为混合组，未使用两种试剂的小鼠为对照组。雌性小鼠饲养3、6、9、12个月后，对比分析四组研究对象的线粒体和卵子数目的各项临床指标。结果：四组研究小鼠饲养3、6个月线粒体活性比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。四组研究小鼠的卵子在3、6个月的线粒体活性均明显高于9个月，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化组与混合组在9个月后的线粒体活性均明显高于重金属组与对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。对照组在3个月时的卵子数目明显均低于其他三组，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化组与混合组在6、9个月的卵子数目均明显高于重金属组与对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化组与混合组、重金属组与对照组在6、9、12个月时卵子数目比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：随年龄增长，小鼠卵子的线粒体活性降低，卵子数目减少。小鼠摄入适量抗氧化剂硫辛酸和乙酰肉碱，可延缓卵母细胞老化。对人类的抗卵子老化有一定的参考价值。

【关键词】 重金属耦合剂 卵子数目 纺锤体老化 抗氧化剂 线粒体

Effects of Heavy Metal Coupling Agents （Ethylenediaminetetraacetic Acid and Sodium Citrate） and Antioxidants （Lipoic Acid and Acetylcarnitine） on the Number of Eggs and Mitochondria in Mice/MA Tianzhong， NIU Yanru， WEI Bing. //Medical Innovation of China， 2020， 17（13）： 0-019

[Abstract] Objective： To investigate the effects of heavy metal couplants （Ethylenediaminetetraacetic Acid and Sodium Citrate） and Antioxidants （Lipoic Acid and Acetylcarnitine） on the number of eggs and mitochondrial activity in mice. Method： A total of 148 female mice of G57BL/6 were selected for the study. 144 mice were finally involved in the experiment due to normal death such as biting each other during the feeding period. 144 mice were randomly divided into 4 groups， 36 mice in each group， the heavy metal couplants group （Ethylenediaminetetraacetic Acid and Sodium Citrate）， the antioxidants group （Lipoic Acid and Acetylcarnitine）， the heavy metal couplants and antioxidants group， that did not use the two reagents in the experiment was the control group. After 3， 6， 9 and 12 months， the clinical indexes of mitochondria and egg number of four groups were compared and analyzed. Result： There were no significant differences in mitochondrial activity among the four groups after 3 and 6 months （P>0.05）. After 3 and 6 months， the activity of mitochondria in the eggs of the four groups were significantly higher than those of 9 months （P<0.05）. After 9 months， the activity of mitochondria in antioxidant group and mixed group were significantly higher than those in heavy metal group and control group （P<0.05）. The number of eggs in the control group were significantly lower than those in the other three groups at 3 months （P<0.05）. The number of eggs at 6 and 9 months in antioxidant group and mixed group were significantly higher than those of heavy metal group and control group （P<0.05）. There were no significant differences in the number of eggs between antioxidant group and mixed group， heavy metal group and control group at 6， 9 and 12 months （P>0.05）. Conclusion： With the increase of age， the mitochondrial activity and the number of eggs decreased. The aging of oocytes could be delayed by appropriate intake of lipoic acid and acetylcarnitine. It has a certain reference value for human anti egg aging.

[Key words] Heavy metal couplant Egg number Spindle aging Antioxidant Mitochondria

First-authors address： Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.13.004

反复性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）和反复种植失败（repeated implantation failure，RIF）共同的特点都表现为早期流产，二者是生殖医学研究的热点，一直备受临床医师关注[1-3]。RSA和RIF严重影响育龄夫妇的生育力，极大损害妇女的身体健康，随着流产次数的不断增加使其对流产产生极度的恐惧[4-5]。因此探究非整倍体在早期流产发生机制，能為诊治反复早期流产提供科学的理论依据，为患者提供合理可靠的生育指导依据[6]。反复性流产和反复种植失败，50%～80%的胚胎染色体异常，均以非整倍体为主[7]。非整倍体即染色体数目异常，是指细胞中染色体的数目不是该物种正常精子或卵子中染色体数目的整数倍。随着女性年龄增大，其体内保障染色体精确分离的保护机制如纺锤体装配检验点（Spindle Assembly Checkpoint，SAC）被“磨损”削弱，而最终导致减数分裂时染色体分离异常[8]。目前卵子染色体产生异常的因素还没有探究清楚，但染色体产生异常分裂的重要因素之一是细胞的氧化应激，细胞的氧化应激可由重金属造成，卵子内抗氧化剂与活性氧的含量可造成卵子非整倍体的出现。本文研究探讨了小鼠卵子数目和线粒体活性受重金属耦合剂（乙二胺四乙酸和柠檬酸钠）与抗氧化剂（硫辛酸和乙酰肉碱）的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 研究对象选定为144只G57BL/6雌性小鼠，实验时间为2018年1月-2019年1月，依据随机分组方式分为四组，每组各36只。实验中使用重金属耦合剂的小鼠为重金属组，使用抗氧化剂的小鼠为抗氧化组，使用重金属耦合剂与抗氧化剂的小鼠为混合组，未使用两种试剂的小鼠为对照组。纳入标准：均满3周龄，且刚刚断乳。排除标准：在饲养期间发生互咬等正常死亡的小鼠，小鼠卵子数目与线粒体膜电位在实验前出现异常。

1.2 方法 将所有研究小鼠放在相同的研究室不同笼子内培养，可自由饮水与觅食，保证每天光照射12 h，设置研究室的温度为（23±2）℃，湿度保证为40%～60%。将四组研究小鼠进一步平均分为四小组，每小组9只小鼠在不同时间点。重金属组：将0.3 mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA，Sigma公司）和0.15 mmol/L柠檬酸钠（Sigma公司）加入在小鼠的日常饮用水中;抗氧化组：将40 mg/L硫辛酸和100 mg/L乙酰肉碱（GNC公司）加入在小鼠的日常饮用水中;混合组：将重金属耦合剂和抗氧化剂同时加入在小鼠的日常饮用水中;对照组：使小鼠只引用普通饮用水。实验所用饮用水是经过滤灭菌的普通自来水，进行3、6、9、12个月的饲养，卵子实验是不同研究组不同时间阶段选的9只小鼠，在实验结束后进行。

1.3 检测成熟卵母细胞的线粒体膜电位变化 依据Sigma公司试剂盒操作说明应用线粒体膜电位检测试剂盒，按照1×染色缓冲工作液比例配比纯水与染色体缓冲液，并与200×JC-1储存液混匀，将水浴箱温度设置为37 ℃，把混合液放入箱内预热。制作液滴，共使用1×染色缓冲工作液50 mL，在其表面盖满矿物油，将培养箱温度设置为37 ℃，进行预热，混合2～3只小鼠的卵子，在MⅡ期卵子中随机抽取15～20个，放入液滴中。将培养箱的温度与体积分数设置为37 ℃、5%CO2，放入20～25 min，进行中孵育，洗涤2～3次在孵育完成后。采用Image J进行检测。

1.4 收集卵子 完成各阶段的饲养后，将10 IU孕马血清（宁波第二激素厂）注入小鼠腹腔，再将10 IU人绒毛膜促性腺激素（宁波第二激素厂）在46～48 h后注入腹腔，期间正常喂予对应饮用水。12～13 h后处死，打开腹腔后剪取双侧输卵管，并分离其他组织，马上放入自配培养液中。清洗3次，将输卵管的膨大部撕开在显微镜下与镊子的作用下，用培养液清洗卵丘-卵母细胞复合体2次，将透明质酸酶（Vitrolife公司）稀释为1︰9的溶液，MⅡ期裸卵在清除颗粒细胞后得到，再次清洗3次应用培养液，计算卵子数目在新的培养液液滴内。

1.5 统计学处理 使用SPSS 19.0统计学软件进行分析处理，计量资料采用（x±s）表示，比较并采用t检验，计数资料采用率（%）表示，比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组检测卵母细胞的线粒体膜电位强度比

较 四组研究小鼠饲养3、6个月线粒体活性比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。四组研究小鼠的卵子在3、6个月的线粒体活性均明显高于9个月，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化组与混合组在9个月后的线粒体活性均明显高于重金属组与对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 四组不同时间段的卵子数目比较 对照组在3个月时的卵子数目均明显低于其他三组，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化组与混合组在6、9个月的卵子数目均明显高于重金属组与对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化组与混合组、重金属组与对照组在6、9、12个月时卵子数目比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

反复性流产（RSA）和反复种植失败（RIF）共同的特点都表现为早期流产，二者是生殖医学研究的热点，一直备受临床医师关注[9]。RSA和RIF严重影响育龄夫妇的生育力，极大损害妇女身体健康，随着流产次数的不断增加使其对流产产生极度的恐惧。造成绝经、不孕、生殖老化的重要因素是生殖细胞功能障碍、卵母细胞老化[10-11]。本文探讨分析小鼠卵子数目、线粒体和纺锤体老化受重金属耦合剂（乙二胺四乙酸和柠檬酸钠）与抗氧化剂（硫辛酸和乙酰肉碱）的影响。

本研究中显示，四组研究小鼠在被饲养3、

6个月的期间中线粒体活性比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。四组研究小鼠的卵子3、6个月线粒体活性均明显高于9个月，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化组与混合组在9个月后的线粒体活性均明显高于重金属组与对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。对照组在3个月时的卵子数目均明显低于其他三组，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化组与混合组在6、9个月的卵子数目均明显高于重金属组与对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。抗氧化組与混合组、重金属组与对照组在6、9、12个月时卵子数目比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。这提示了使用抗氧化剂可以减慢线粒体活性降低，维持纺锤体的正常形态，增加卵母细胞的数量[12-13]。抗氧化组效果之所以优越，是因为其可延缓卵母细胞的一系列老化，而其他组效果之所以欠缺，是因为未见其有与抗氧化组相同的作用效果[14-15]。

综上所述，随年龄增长小鼠卵子的线粒体活性降低，卵子数目减少。小鼠摄入适量抗氧化剂硫辛酸和乙酰肉碱，可以减慢线粒体活性降低，增加卵母细胞的数量，延缓卵母细胞老化。对人类的抗卵子老化有一定的参考意义，有待进一步研究。

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（收稿日期：2019-10-29） （本文編辑：周亚杰）