黑水虻幼虫抗菌肽粗提物敏感肿瘤细胞株筛选及溶血作用研究

冯群，高嘉敏，夏嫱

(遵义医科大学珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地，广东 珠海519041)

肿瘤是导致人类死亡的主要原因，预计到2035 年每年新增肿瘤病例2 400 万，死亡人数将突破1 300 万［1］。肿瘤的传统治疗方法以手术和放化疗为主，不良反应大，且存在复发、多药耐药以及机体免疫力低下的风险，进一步增加了肿瘤治疗的难度。其中肿瘤普遍存在的多药耐药及如何提高药物靶向性一直是研究的热点和难点，对此学者们将肿瘤药物的研发转向天然生物产物，期望能够找到一种新的、高效无毒的抗肿瘤药物替代或部分替代常规化疗药物［2］。天然多肽分子抗菌肽除具备抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、免疫调节、伤口愈合以及中和体内毒素等活性外，还具有抗肿瘤活性，如LL-37 是唯一一个来自人类的免疫防御肽，其可诱导结肠癌细胞发生凋亡［3］;SALF、Pardaxin 和HPRP-A1抗菌肽能诱导宫颈癌HeLa 细胞凋亡［4-6］;抗菌肽17BIPHE2 可显著抑制肺腺癌A549 细胞增殖［7］;蜘蛛来源肽Gomesin 可抑制小鼠黑色素瘤、乳腺癌和结肠癌细胞增殖，且对正常细胞无明显影响［8-9］。以上研究均表明抗菌肽具有抗癌活性。

黑水虻black soldier fly，Hermetia illucens L.(Diptera:Stratiomyidae)，学名亮斑扁角水虻，是一种与蝇蛆、黄粉虫等齐名的双翅目水虻科的重要资源昆虫，全球分布广泛［10］，长期暴露的生存环境使其形成了强大的先天免疫系统。对黑水虻来源抗菌肽的研究始于2013 年［11］，目前黑水虻抗菌肽已在大肠埃希菌和毕赤酵母X-33 中成功表达，并表现出对革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌良好的抑菌活性［12-13］，与其 他 昆 虫 来 源 肽 如 天 蚕 素［14］、Bmattacin 2［15］、cecropins［16］、ABP-dHC-A-K［17］、黄粉虫防御素［18］以及蜂毒素［19］等的作用一致，表明黑水虻抗菌肽在未来医药研发方面具备巨大潜能。然而，黑水虻抗菌肽抑癌活性的研究鲜见报道，本研究以黑水虻幼虫抗菌肽为研究对象，探讨其抗癌及溶血效应，旨在为未来抗肿瘤药物的研发提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 黑水虻虫卵来自珠海市农业科学研究院;雄性豚鼠，4 只，2 ～3 月龄、体重300 ～350 g，合格证号:SCXK(京)2016-0002，由遵义医学院珠海校区实验动物研究中心提供。

1.1.2 细胞株 结肠癌细胞株(HCT-8)、肺腺癌细胞株(A549)、宫颈癌细胞株(HeLa)、卵巢癌细胞株(SKOV3)以及正常人胚肾细胞株(HEK293)标准株购于中国科学院上海ATCC 细胞库。

1.1.3 主要试剂 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)购于美国Sigma 公司;RPMI-1640、DMEM(Dulbecco's modification of Eagle' s medium Dulbecco)、MEM(Minimum Essential Medium)、McCoy's 5A (McCoy's 5a medium)培养基以及氨苄青霉素、链霉素产品购于澳大利亚Gibco 公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;CCK(cell counting kit)-8试剂盒购自日本同仁公司，批号:LF673。

1.1.4 主要仪器 高速冷冻离心机(3K15，美国Thermo fisher 公司);精密电子天平(BSA-124S 型，德国赛多利斯科学仪器有限公司);倒置荧光显微镜(IX71，日本OLYMPUS 公司);二氧化碳培养箱(HF90，中国Heal Force 公司);全自动酶标仪(Elx-800 型，德国莱卡公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 黑水虻抗菌肽粗提物的诱导提取 抗菌肽的诱导提取参照夏嫱等［11］的提取方法，用金黄色葡萄球菌诱导黑水虻5 龄幼虫，常规饲养24 h 后采用断头取血法收集幼虫血淋巴。将收集的血淋巴于4 ℃、13 225 ×g 离心15 min，轻轻吸取上清后转移至50 mL 超滤管中(规格:10 kD)，4 ℃、5 000 ×g 离心35 min，然后转移滤液至3 kD 的超滤管中，4 ℃、5 000 ×g 离心20 min，截留部分即抗菌肽粗提液。透析24 h 除去部分盐和色素，于-80 ℃冰箱过夜，真空冷冻干燥，收集抗菌肽粗提物粉末于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 细胞的体外生长曲线 ①取对数期HCT-8、A549、HeLa、SKOV3 和HEK293 细胞分别培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640(HCT-8 和A549)、MEM(HeLa)、McCoy's 5A(SKOV3)和DMEM(HEK293)培养基中，待细胞贴壁达80%时弃除培养基，胰蛋白酶消化，用0.9%氯化钠注射液制成细胞悬液，并调节细胞密度为7 ×104个/mL，以100 μL/孔的量将细胞悬液铺于96 孔板中，分别设置实验组和空白对照组，每组4 个复孔，于37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养4 d。②每日取出需要检测的96 孔板，每孔加入10 μL CCK-8，再放入37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养1.5 h，用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度值，并以时间为横坐标，A 值为纵坐标，绘制每株细胞的生长曲线。

1.2.3 敏感肿瘤细胞株筛选 ①细胞铺板步骤同

1.2.2。②培养24 h 后，倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞生长状态良好时，吸出原培养基，分别向每株细胞的实验组添加100 μL 浓度为12. 5、25、50、100、200 和400 mg/L 的黑水虻抗菌肽粗提物溶液(常规培养基配制)，阴性对照组则加入100 μL常规培养基，每组设4 个复孔，放回培养箱继续培养。③作用24 h 后，向每孔细胞加入10 μL CCK-8检测试剂，放回细胞培养箱中继续培养1.5 h，之后用酶标仪检测波长为490 nm 处的吸光度值。计算出每株细胞的抑制率，具体公式:抑制率(%)=A(阴性对照组)- A(实验组)/A(阴性对照)×100%。比较4 株肿瘤细胞的增殖抑制率，筛选出对黑水虻抗菌肽粗提物较敏感的肿瘤细胞株。④筛选出敏感肿瘤细胞株后，在相同条件下与阳性对照药物5-FU 比较。

1.2.4 黑水虻抗菌肽粗提物对正常细胞影响 检测抗菌肽粗提物对正常细胞HEK293 的毒性作用，细胞培养、铺板及抗菌肽粗提物浓度设置步骤同1.2.3。

1.2.5 黑水虻抗菌肽粗提物对红细胞溶血的影响

①采用心脏采血法采集健康豚鼠血液2 mL，离心收集血细胞，轻轻吸出红细胞层至另外一支洁净试管，磷酸盐缓冲液洗涤4 次，用0.9%氯化钠注射液配成2%的红细胞悬液。②用0.9%氯化钠注射液配制浓度为1 000 mg/L 抗菌肽粗提物，再用0.9%氯化钠注射液对粗提物溶液进行倍比稀释，实验浓度设置为62.5、125、250、500、1 000 mg/L。③取出一块96 孔板，所需孔先加入50 μL 2%的红细胞悬液，向实验组加入50 μL 不同浓度的抗菌肽粗提物，使实验组抗菌肽粗提物的终浓度为31.25、62.5、125、250、500 mg/L，阴性对照组加入等量0.9%氯化钠注射液，阳性对照组加入等量纯水，每组设置4 个复孔。④加完样，轻轻晃动96 孔板使细胞均匀分布，放入37 ℃的培养箱中孵育1 h，取出后1 000 ×g 离心5 min，然后吸出60 μL 上清至新的96 孔板中，利用酶标仪测定414 nm 处的吸光度A 值。溶血率(%)=〔A(实验孔)-A(阴性孔)〕/〔A(阳性孔)-A(阴性孔)〕×100%。

1.3 检测指标 绘制4 种肿瘤细胞和正常细胞的生长曲线;比较黑水虻抗菌肽粗提物对4 种肿瘤细胞和正常细胞的抑制情况;在抑制率最高的浓度下，对各组细胞的抑制情况;比较黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 对HCT-8 细胞的抑制作用;观察黑水虻抗菌肽粗提物对红细胞的溶血作用。

1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4 株癌细胞和1 株正常细胞的生长曲线 4 株癌细胞(A549、HeLa、SKOV3、HCT-8)和1 株正常细胞(HEK293)均在培养1 d 后进入对数生长期，3 d达到峰值，之后逐渐下降。故选取培养1 d 的细胞进行传代及后续实验。见图1。

图1 5 株细胞的生长曲线

2.2 不同浓度的黑水虻抗菌肽粗提物对5 种细胞的增殖抑制率 不同浓度的黑水虻抗菌肽粗提物对HCT-8、A549、SKOV3、HeLa 4 种细胞均有一定的抑制作用(P ＜0.05)，且随着浓度的增加，抑制率逐渐升高，其中400 mg/L 浓度下的黑水虻抗菌肽粗提物对肿瘤细胞的抑制率最大。不同浓度的黑水虻抗菌肽粗提物对HEK293 无抑制作用(P ＞0. 05)。在400 mg/L 浓度下，黑水虻抗菌肽粗提物对HCT-8、A549、SKOV3、HeLa 以及HEK293 5 种细胞的抑制率不同(F=54.495，P ＜0.001)，其中对HCT-8 细胞的抑制率最高，对HEK293 的抑制率最低。见表1。

表1 不同浓度的黑水虻抗菌肽粗提物作用24 h对5 种细胞的增殖抑制率 (%，±s)

表1 不同浓度的黑水虻抗菌肽粗提物作用24 h对5 种细胞的增殖抑制率 (%，±s)

a 与12.5 mg/L 组比较，P ＜0.05

HCT-8 A549 SKVO3 HeLa HEK293 12.5 mg/L 组 5.68±1.21 7.71±1.66 8.25±2.05 8.67±0.55 1.67±2.65 25 mg/L 组 6.09±1.77a 8.14±1.74a 13.50±1.58a 10.64±0.33a 3.33±2.23 50 mg/L 组 8.07±1.02a 8.18±1.21a 10.95±0.91a 12.26±0.31a 3.35±2.62 100 mg/L 组 15.48±1.44a 8.54±0.75a 18.28±2.85a 12.17±0.52a 5.33±3.93 200 mg/L 组 25.81±2.04a 8.55±0.94a 18.69±1.69a 13.84±0.61a 8.18±2.89 400 mg/L 组 41.76±7.34a 10.72±0.87a 21.06±0.82a 20.81±0.21a 9.93±2.07 F 值组别196.596 6.191 62.680 11.066 2.442 P 值＜0.001 0.005 ＜0.001 ＜0.001 0.074

2.3 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 对HCT-8 细胞的抑制作用比较 黑水虻抗菌肽粗提物在12.5、25、50、100 mg/L 时对HCT-8 细胞的抑制率与50 mg/L 的5-FU 对HCT-8 细胞的抑制率比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，且粗提物的作用较5-FU 弱。当黑水虻抗菌肽粗提物浓度为200 mg/L 时，与5-FU 处理组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。黑水虻抗菌肽粗提物浓度为400 mg/L 时，对HCT-8 细胞的抑制率较5-FU 处理组高(P ＜0.05)。见表2。

表2 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 对HCT-8细胞的体外增殖作用比较 (%，±s)

表2 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 对HCT-8细胞的体外增殖作用比较 (%，±s)

5-FU:5-氟尿嘧啶;a 与5-FU 处理组比较，P ＜0.05

组别 抑制率50 mg/L 5-FU 组 24.58 ±0.88 12.5 mg/L 组 5.57 ±0.85a 25 mg/L 组 6.09 ±2.50a 50 mg/L 组 8.07 ±1.20a 100 mg/L 组 15.38 ±1.18a 200 mg/L 组 25.82 ±2.26 400 mg/L 组 41.77 ±2.13a F 值176.396 P 值＜0.001

2.4 黑水虻抗菌肽粗提物对红细胞的溶血作用抗菌肽粗提物的浓度为0、31. 25、62. 5、125、250、500 mg/L 时的溶血率分别为0、(0.16 ±0.11)%、(0. 20 ± 0. 12)%、(0. 95 ± 0. 04)%、(1. 09 ±0.16)%、(1.60 ±0.18)%、组间比较差异无统计学意义(F=1.778，P=0.210)，且溶血率均低于5%。

3 讨 论

CCK-8 是一种细胞活性检测剂，目前已被广泛用于多个领域，如新药筛选、细胞毒性鉴定及肿瘤放射敏感性观察等，该检测方法在操作上具有简单、快速、重复性好、效率高等优点。本课题组采用CCK-8探讨黑水虻幼虫抗菌肽粗提物对HCT-8、A549、SKOV3和HeLa 4 种癌细胞株的增殖抑制情况发现，抗菌肽粗提物对4 株癌细胞的增殖均有一定的抑制作用，尤其是对HCT-8 的作用较明显，随着浓度的升高抑制率也升高。与HCT-8 细胞株的阳性药物5-FU 比较发现，低浓度抗菌肽粗提物的作用较5-FU的作用弱，当浓度达到400 mg/L 时，效果则优于5-FU，表明高浓度黑水虻抗菌肽粗提物有望代替或者部分代替5-FU 用于未来结肠癌的治疗。本研究以正常HEK293 细胞作为阴性对照细胞，探究抗菌肽在作用于癌细胞的同时是否也作用于正常细胞，以保障实验的完整性。结果显示，黑水虻抗菌肽对正常细胞的毒性较小，表明黑水虻抗菌肽粗提物的抗癌作用具有选择性。关于作用机制有研究认为，抗菌肽可作用于肿瘤细胞的细胞膜和线粒体膜，影响DNA 复制;或通过产生大量活性氧类、增加Ca2+内流等激活信号通路;也可通过激活和聚集树突状细胞，从而提高机体免疫力［20］。此外，抗菌肽还可作为一种免疫佐剂，通过增强淋巴细胞的表达，发挥抗肿瘤作用［21］。但不同来源的抗菌肽的作用机制存在差异。因此，黑水虻来源肽的作用机制有待进一步研究。

溶血即红细胞被破坏后，血红蛋白被释放出来的现象，说明某物质具有破坏红细胞胞膜的作用，间接反映该物质的安全性。近年来，一些抗菌肽如Cecropin A 和B、Magainin、melittin、Tachyplesin I、cathelicidin 家族PR-39、Mastoparan 及人工合成的抗菌肽CM-S 被认为是理想的抗肿瘤药物［22-24］，但因其在体内具有溶血作用而导致应用受限。因而需要对已有抗菌肽的结构进行改造或者寻找新的抗菌肽来源，卢亚丽等［25］报道，动物内源性抗菌肽CGA-N46、JH-3 不具有溶血作用。Kim 等［26］报道，Harmoniasin类似物HaA4 可在不溶血的情况下作用于白血病细胞U937 和Jurkat 细胞。Sang 等［17］研究报道，天蚕素类似物ABP-dHC-Cecropin A 对K562、U937 和THP-1等白血病细胞具有浓度依赖性细胞毒性，其在最高检测浓度(800 μmol/L)时也未显示出明显的溶血活性。夏一赫等［27］发现，抗菌肽JH-3 的溶血率低于5%。本研究测定了黑水虻抗菌肽粗提物对红细胞的溶血性，结果发现，黑水虻抗菌肽粗提物的浓度不大于500 mg/L 时对红细胞也无溶血活性，表明黑水虻抗菌肽有较好的安全性。

目前，在已发现的具有抗癌活性的200 种抗微生物肽中，有些抗菌肽已进入Ⅲ期临床试验阶段［28］，且尚未发现癌细胞对抗菌肽有耐药现象，甚至有抗菌肽具有逆转耐药的作用［29］，显示抗菌肽在抗癌药物研发方面的巨大潜力。本研究表明，黑水虻抗菌肽对癌细胞具有选择性作用，对正常细胞无毒、对红细胞不溶血，是未来肿瘤药物研发得较好来源之一。