不同粮食曲的理化特性及其微生物群落结构

李媛媛，罗碧霞，张兰兰，姚亚林，郭燕，黄治国,2*,任志强,2*

1(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾， 644000)2(酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾， 644000)

大米、糯米、玉米、高粱和小麦这5种粮食是常用的酿酒原料，它们都含有较为丰富的营养物质，但是所含物质的种类和含量却各有差异，使得它们酿造出的酒质也各有千秋[1-2]。酒质的差异除了粮食本身的理化特性不同之外，还与酶制剂——即酒曲，有很大的关系[3-4]。

酒曲实际上是一种微生物培养基，可富集环境中的酿造微生物[5]。这些微生物所分泌的一些具有生物催化作用的酶如淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，可以将谷物中的营养物质如葡萄糖和蛋白质等转变成糖、氨基酸，糖分再在酵母菌的作用下，分解成乙醇，即酒精[6-8]。酒曲的制作原料通常为小麦、大麦、豌豆或者米粉。目前鲜有以高粱、玉米等酿酒原料为制曲原料的相关报道，仅有刘国英等[9]报道过以豌豆、小麦和大麦为原料的多粮制曲，但是对多种不同酿酒原料制曲的研究还很少。

不同的粮食有各自不同的特点，利用原料本身富集微生物，可能更加利于利用原料。因此本文将常用的5种酿酒粮食制作成曲，并对曲的一些理化性质、风味物质和曲中所含的微生物进行了检测及分析，以期为进一步提升白酒质量寻找新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米，市售东北籼大米；糯米，市售南方圆糯米；高粱，市售南方散穗型红高粱；小麦，市售红皮小麦；玉米：市售黄玉米。

NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、可溶性淀粉、L-酪氨酸、干酪素、己酸、无水乙醇、葡萄糖 (均为分析纯)，成都市科龙化工试剂厂;H2SO4、HCl(均为分析纯)，重庆川东化工有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1200型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；GC7890-5975MSD气相色谱-质谱联用仪，Agilent科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 粮食的理化指标测定

水分的测定，烘干法；淀粉的测定，斐林试剂法[10]；直链淀粉和支链淀粉的测定，双波长法[11]；蛋白质含量的测定，双缩脲法[12]；脂肪的测定，参照GB/T 5512—2018粮油检验粮食中粗脂肪含量的测定[13]中的方法步骤。

1.3.2 曲的制作工艺

参照文献[8]中的制曲工艺：

粮食粉粹→加水糊化(控制水分质量分数35%～38%)→冷却后用磨具压成型→送入酒厂曲房培养30 d→储藏

操作要点：5种粮食分别称取6 kg，每种粮食各制作3块曲；糊化过程中，水的温度为100 ℃。

1.3.3 曲的理化性质测定

曲的糖化力、发酵力、酯化力均参照参考文献[14]中的方法步骤，其中糖化酶活力的定义为1 g绝干曲在40 ℃，pH 4.6的环境下反应1 h后，将淀粉分解成葡萄糖的毫克数，1 mg即1个酶活单位(U/g)[15]。

1.3.4 曲的GC-MS成分分析

顶空固微相萃取操作过程:称取3 g曲粉和1 g NaCl于顶空瓶中，将顶空瓶放入全自动固相微萃取仪中，55 ℃平衡10 min后，萃取30 min。

GC-MS的风味分析条件：DB-WAX色谱柱(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm) 毛细管色谱柱；进样口温度250 ℃；分流比20∶1；程序升温为初始温度40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升温至130 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持4 min；色谱-质谱接口温度为240 ℃；离子源温度为200 ℃；四极杆温度为150 ℃；溶剂延迟3 min；离子化方式为电子电离(electron ionization，EI)；电子能量为70 eV；扫描方式为全扫描。

1.3.5 曲的基因组提取

本试验采用改良的十六烷基三甲基溴化胺(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法[16]提取曲中微生物的基因组。

1.4 数据分析

曲的理化指标试验结果用平均值±标准差表示，使用SPSS 20.0软件中的一般线性模型单因素Duncan法对数据进行方差分析和相关性分析。将高通量测序所得序列与Silva数据库进行比对，获得操作分类单位 (operational taxonomic units, OTU) 分类。再利用SPSS 20.0软件对曲的质量指标和微生物群落结构进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 五种粮食的理化特性

粮食中的营养成分是曲中微生物生长的必要条件，其中淀粉是由葡萄糖分子聚合而成，为微生物的生长提供碳源；蛋白质是由氨基酸分子聚合而成，为微生物的生长提供氮源；脂肪是由甘油和脂肪酸组合成的三酰甘油酯，可以较好地调节微生物生长环境的pH[17]。白酒曲除了要求有一定数量的微生物之外，还须累计多种胞内酶和胞外酶，其中最主要的是淀粉酶，而此类酶多为诱导酶，故要求制曲原料含有较多的淀粉；蛋白质也是产酶的必要成分，故制曲原料应含有适宜的蛋白质。因此考察不同酿酒粮食中的这些成分含量是必要的。如表1所示，5种酿酒粮食的成分含量，其中5种粮食的水分含量都低于14%(质量分数)，符合《白酒生产全书》中所提及的原料水分含量要求，说明粮食没有霉变；并且5种粮食都含有微生物生长和繁殖所需的营养成分，表明这5种酿酒原料制曲是可行的。

表1 不同粮食的营养成分 单位：%(质量分数)

2.2 不同粮食曲的糖化酶活力

糖化酶活力是曲的重要指标，曲中的糖化酶可以将淀粉转化为可发酵性糖，糖分再由酵母分解成酒精，较高的糖化酶活力可以大大提升原料利用率和出酒率，因此检测曲的糖化酶活力是有必要的。如图1所示，不同粮食曲的糖化酶活力高低依次为大米曲>小麦曲>玉米曲>糯米曲>高粱曲，且都达到了显著水平(P<0.05)，大米曲的糖化酶活力最高，为180.9 U/g，高粱曲的糖化酶活力最低，为80 U/g。同为米类的大米和糯米在糖化酶活力上差距很大，可能是由于糯米中脂肪含量过高，使得曲中pH过低，不利于霉菌的生长；大米曲的酶活力高可能是因为大米中淀粉含量较高，曲中分泌糖化酶的霉菌生长较其余4种曲更好，这可能也是糖化力较高的小曲常用大米为原料的原因之一。高粱曲酶活力过低，可能也与高粱中脂肪含量有关，此外，高粱在粉碎时，皮壳与其一同粉碎，由于当中皮壳的影响，在制曲过程中使得高粱曲不易成型，水分较易散失，曲中的微生物含量少，导致其酶活力较低。

图1 不同粮食曲的糖化酶活力Fig.1 Glycosylase activity of different grain kojis注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.3 不同粮食曲的发酵力

曲的发酵力是反映曲产酒的重要指标，是酵母将可发酵性糖转化为酒精的能力。如图2-a所示，5种不同粮食曲的发酵力高低依次为大米曲>小麦曲>玉米曲>糯米曲>高粱曲，且都达到了显著差异水平(P<0.05)，大米曲的发酵力最高，达到了0.86 g/(g·36 h)，可能是由于大米的淀粉含量高，碳源充足，酵母生长繁殖快，产气多造成；糯米的淀粉含量高，但糯米曲的发酵力却很低，其原因可能是糯米中支链淀粉的含量过高，在制曲时不易成型，水分散失过快，酵母数量少；1 g曲中酵母数量如图2-b所示，与发酵力的高低相符合，证明了酵母是产发酵力的主要来源，与以上猜测不同粮食曲的发酵力不同的原因是一致的。

a-不同粮食曲的发酵力；b-不同粮食曲中酵母数量图2 不同粮食曲的发酵力和不同粮食曲中酵母数量Fig.2 Fermentation capacity and the number of yeast in different grain kojis

2.4 不同粮食曲的酯化力

曲的酯化力是曲中微生物所代谢的酯化酶催化酸和醇合成酯类物质的能力，而酯类化合物是白酒主要风味物质，因此酯化力也是曲的一个重要指标[18]。如图3所示，不同粮食曲酯化力的高低为小麦曲>高粱曲>大米曲>糯米曲>玉米曲；糯米曲与玉米曲的酯化力分别为10.5、10.3 mg/(g·100 h)，两者差异不显著(P>0.05)，而大米、小麦和高粱曲的酯化力分别为16.4、26.4、20.5 mg/(g·100 h)，且都显著高于(P<0.05)糯米曲与玉米曲，它们之间也呈显著差异(P<0.05)。小麦中蛋白质的含量高，有充足的氮源，小麦曲中芽孢杆菌属(Bacillus)的数量较高，而这一菌属与酯化力的相关系数为0.421，这就使得小麦曲的酯化力高于其余4种粮食曲。

图3 不同粮食曲的酯化力Fig.3 Esterification capacity of different grain kojis

2.5 不同粮食曲中的挥发性物质

酒曲除了是白酒酿造中的糖化发酵剂以外，也是生香剂。在酿造过程中，曲中原料的分解产物和微生物的代谢产物，直接或间接地构成了白酒的风味物质；并且对酒曲的感观鉴评除了对其外观的判定以外，闻香也是鉴评的方式之一，即对酒曲中香气成分所表现的综合香气进行感官评价。因此，测定酒曲中的风味物质不仅有助于了解该曲酿造出的白酒中香气成分，还有助于对酒曲质量的判别。

5种不同粮食制作的曲总共测出了66种组分，按照其化学结构的特点，分为醇类(5种)、酯类(17种)、酸类(2种)、芳香类(11种)、吡嗪类(4种)、烷烯类(12种)、醛酮类(9种)、杂环类(6种)。每种曲中的挥发性组分的种类数量和不同种类化合物的含量如图4、图5所示。

图4 不同粮食曲挥发性物质中不同化合物的种类数量Fig.4 Types of different compounds of different grain kojis volatile substances

图5 不同粮食曲挥发性物质中不同种类化合物的含量Fig.5 Contents of different kinds of compounds in volatile materials of different grains

从曲的感观香味来看，小麦曲的麦香味比其余4种曲要重一些，但是另外4种曲的其他香味却要比小麦曲更浓厚，并且也各有不同；5种不同粮食曲中的挥发性组分的种类数量和含量是有所不同的，在高粱曲、糯米曲、大米曲、小麦曲和玉米曲的样品中分别检测到了27、35、24、37、21种物质；其中小麦曲检测到的挥发性物质种类最多，更为复杂、丰富；但是小麦曲的物质种类虽多，总含量却很少，远不及大米曲、糯米曲和高粱曲，使得这3种曲的气味比小麦曲更加浓郁。

2.6 不同粮食曲微生物群落分析

2.6.1 不同粮食曲中真菌属的分类

如图6所示，除去丰度低于1%的菌属(others)，在5种粮食曲里总共检测出了5种优势真菌菌属类。

图6 不同粮食曲中真菌属的分类Fig.6 Classification of fungal genus in different grain kojis

大米曲的优势菌属为嗜热子囊菌属(Thermoascus，93.02%)和曲霉属(Asporgillus，6.11%)；曲霉属(Asporgillus，96.37%)在糯米曲中所占比例最高；高粱曲中占主导地位的菌属为嗜热子囊菌属(Thermoascus， 38.62%)、曲霉属(Asporgillus， 34.94%)、嗜热真菌属(Thermomyces， 16.54%)以及Rasamsonia属(8.94%)；小麦曲中大都为嗜热子囊菌属(Thermoascus， 96.03%)；嗜热子囊菌属(Thermoascus， 61.74%)和曲霉属(Asporgillus， 36.87%)为玉米曲的优势菌属。白酒酿造中菌类的作用大致为糖化动力——霉菌，发酵动力——酵母菌；由图1和图2可知，不同粮食曲的糖化酶活力和发酵力的高低依次为大米曲>小麦曲>玉米曲>糯米曲>高粱曲，这可能与曲中嗜热子囊菌属(Thermoascus)和曲霉属(Asporgillus)的占比含量有关，大米曲的糖化力和发酵力高，而高粱曲低，可能就是由于高粱曲除去以上所述的2种菌属以外，其余作用不大的菌属占比也很高，才会导致其发酵力和糖化力低。

2.6.2 不同粮食曲中细菌属的分类

如图7所示，除去丰度<1%的菌属(others)，在5种曲中共检测出了12种优势细菌属类，其中大米曲检测出10种，糯米曲5种，高粱曲4种，小麦曲6种，玉米曲10种，大米曲和玉米曲的细菌属类最多。其中大米曲的优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus， 25.38%)、Kosakonia属(15.70%)，肠杆菌属(Enterobacter，7.82%)，链霉菌属(Streptomyces，6.32%)；糯米曲中芽孢杆菌属(Bacillus，70.52%)、Kosakonia属(11.98%)、肠杆菌属(Enterobacter，8.94%)所占比例较高；高粱曲中占主导地位的菌属主要为芽孢杆菌属(Bacillus，63.97%)、Kosakonia属(23.63%)；而小麦曲中大都为芽孢杆菌属(Bacillus，79.93%)；此外，芽孢杆菌属(Bacillus，51.46%)、魏斯式菌属(Weissella，23.26%)、Kosakonia属(6.25%)为玉米曲的优势菌属。整体来看，5种曲的优势菌属都很相似，不同粮食曲中细菌属类和而不同，细菌是酒曲培制和白酒酿造的生香动力；例如，芽孢杆菌属(Bacillus)因能形成芽孢而对环境有强耐受能力，是白酒酿造中产酶生香的重要微生物之一[19]；魏斯式菌属(Weissella)属于乳酸菌属，能代谢产乳酸，从而形成乳酸乙酯，为白酒提升香味，也是白酒酿造中重要的微生物之一[20]。可能是因为不同曲中微生物的差异导致不同粮食曲酿造出的白酒各具特色。

图7 不同粮食曲中细菌属的分类Fig.7 Classification of bacterial genus in different grain kojis

由图3所知，小麦曲的酯化力最高，大米曲和玉米曲都相对较低；小麦曲中细菌属类虽少，但其芽孢杆菌属(Bacillus)所占比例特别高，而芽孢杆菌属(Bacillus)具有蛋白质的分解能力和形成少量的双乙酰，可能是此原因才使得小麦曲的酯化力比其他的粮食曲高。

2.7 不同粮食曲的微生物群落与理化指标的相关性分析

利用SPSS数据分析软件，将样品中属类下丰度>1%的菌属与糖化力、发酵力和酯化力进行Pearson相关性分析，研究不同粮食曲中微生物群落与这3个质量指标之间的相互关系，真菌群落关系如表2所示。

表2 不同粮食曲的真菌群落与理化指标的相关性分析Table 2 Correlation analysis between fungal communities and physical and chemical indicators of different grain kojis

由表2可知，在考察的菌属当中，没有显著相关的菌属，但是嗜热子囊菌属(Thermoascus)与糖化力和发酵力的相关系数分别为0.793和0.842，说明粮食曲的糖化力和发酵力与嗜热子囊菌属(Thermoascus)的确有一定的相关性，这与之前猜测大米曲糖化力和发酵力高的原因跟这一菌属有关不谋而合。

细菌群落关系如表3所示。由表3可知，在所考察的菌属当中没有与酯化力呈显著相关的菌属，但是芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和糖多孢菌属(Saccharopolyspora)与酯化力还是有一定的正相关性，并且芽孢杆菌属(Bacillus)的相关系数为0.421，较其余2种菌属的相关系数高，这也与之前猜测小麦曲酯化力高的原因不谋而合；另外发现链霉菌属(Streptomyces)和糖多孢菌属(Saccharopolyspora)与糖化力和发酵力有极显著相关关系，这可能是由于这2种菌在糖化过程与某些真菌有相协同的作用，使得它们与这2种力有相关性。

表3 不同粮食曲的细菌群落与理化指标的相关性分析Table 3 Correlation analysis between bacterial communities and physical and chemical indicators of different grain cultivars

注：*表示差异显著；**表示差异极显著

3 结论

对不同粮食的理化特性进行测定，结果显示,5种粮食的水分含量都低于14%，达到了粮食无霉变的要求，大米的淀粉含量最高，小麦的蛋白质含量高，玉米的脂肪含量在5种粮食中最高；总体来说，5种粮食都具有微生物所需要的碳源和氮源等营养物质，符合制曲原料的要求。5种粮食曲的理化特性研究表明5种粮食曲的糖化酶活力和发酵力高低依次为大米曲>小麦曲>玉米曲>糯米曲>高粱曲，酯化力高低依次为小麦曲>高粱曲>大米曲>糯米曲>玉米曲。从微生物群落结构中得知，5种粮食曲的糖化力和发酵力可能与曲中嗜热子囊菌属(Thermoascus)的含量占比有关，而它们的酯化力可能与芽孢杆菌属(Bacillus)的含量占比有关。5种粮食曲的风味物质，小麦曲所检测到的物质最多。整体看来，大米曲的效果较好，但是大米的成本会较小麦高出很多，在实际生产中，可以用大米曲酿造一些高品质的酒。虽然大米曲的糖化力和发酵力高，但酯化力却还不如小麦曲和高粱曲，可能是因为大米中蛋白质含量较低，以至于大米曲中一些产酯细菌少。各个粮食的营养成分各有所长，因此在以后制曲原料的选择中，可以以多种粮食的形式制作成多粮曲，各个粮食取长补短，博采众长，以富集对原料作用效果更好的微生物，为提升白酒质量提供一个新方向。