响应面法优化超声辅助酶解制备大豆降血糖肽的研究*

段双庚 张佳鑫 江明珠*

1（江苏科技大学生物技术学院，江苏镇江 212018）

2（江苏省大港中学，江苏镇江 212028）

糖尿病逐渐成为继肿瘤、心脑血管疾病之后的第三大人类健康杀手，其中多为Ⅱ型糖尿病。目前服用阿卡波糖等降血糖药物存在恶心、呕吐等不良反应，而具有降血糖功效的天然降糖产物能很好地弥补这些缺陷。有研究表明，蛋白水解产生的多肽可以作为一类α-葡萄糖苷酶抑制剂，与小肠绒毛细胞表面的α-葡萄糖苷酶活性部位结合，阻碍双糖水解，降低餐后血糖，具有辅助降血糖的作用。目前，蚕蛹降糖多肽、汉麻籽粕多肽、啤酒糟多肽、苦瓜多肽和鲨鱼肝多肽等均被证明有降血糖活性。大豆含38%以上的蛋白质，氨基酸种类较全，是一种优良的植物源蛋白质，而目前关于大豆降血糖多肽的研究报道较少。

超声波可改变大分子物质的分子结构、空间构型，使其易于降解。蛋白质经过超声波预处理再用蛋白酶处理，可促进酶解进程，提高多肽得率。本研究利用超声辅助酶解大豆蛋白，应用响应面法分析试验提高大豆蛋白降血糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率，为大豆降血糖肽的后续研究提供理论依据，也为大豆蛋白的综合利用提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小白鼠，江苏大学实验动物中心（合格证编号:NO.201600107）。

大豆分离蛋白，河南天辰生物科技有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶，国药集团（上海）化学试剂有限公司；碱性蛋白酶，北京奥博星生物技术有限责任公司；菠萝蛋白酶，江苏锐阳生物科技有限公司；对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（PNPG），阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

超声波发生器，张家港锦涛超声电器有限公司；UV-9100 型分光光度计，美国尤尼柯（上海）仪器有限公司；SpectraMax i3 多功能酶标仪，美国分子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠源α-葡萄糖苷酶制备

脱臼处死小白鼠，用0 ℃生理盐水洗去杂物，液氮中研磨。将pH 值6.8、浓度0.05 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（PBS）与液氮研磨粉混合，按照体积质量比10∶1 配比，涡旋提取60 s，4 ℃、8 000 r/min 离心15 min，取上清。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测

参考李婷等方法并进行一定修改：96 孔板上加80 μL PBS 缓冲液（pH 值6.8），再加入小鼠小肠提取液10 μL，10 μL 样品溶液，混匀，37 ℃恒温静置15 min，加入10 μ L 5mg/mL 的PNPG，混匀后37 ℃下恒温反应15 min。加入100 μL 0.5 mol/L 的Na2CO3溶液终止反应，于405 nm 波长下测定吸光值（OD），计算公式为：

现有文献从贸易边际的角度来分析物流绩效对一国产品出口影响的并不多。盛丹和包群（2011）［17］认为基础设施的建设能显著促进出口增长的二元边际，且对扩展边际的促进作用优于集约边际。黄玖立和徐旻鸿 （2012）［18］考察了境内运输成本对地区出口模式的影响，认为境内运输成本显著制约着一个地区产品出口的扩展边际，而对集约边际的影响并不明显。而Feenstra和Ma（2014）［19］在考虑经合组织内部贸易时，发现港口效率对出口集约边际的影响比对出口扩展边际的影响更为显著。

其中：ODA表示反应中不加抑制剂的试验组吸光值；ODB表示反应中加抑制剂的试验组吸光值；ODC表示空白试验组的吸光值，以缓冲液代替抑制剂和PNPG 溶液，消除试剂底色对吸光值的影响。

1.3.3 多肽含量的检测

采用Folin-酚法测定。

1.3.4 蛋白水解酶筛选方法

称取大豆蛋白，按料液比为6∶100（g∶mL）配制，用1 mol/L NaOH 溶液调pH 值为11，以促进蛋白溶解，室温下搅拌30 min；调节pH 值为各蛋白酶的最适pH 值，酶与底物比为5 000 U/g，在各蛋白酶的最适温度下反应30 min，100 ℃灭酶活10 min，8 000 r/min 离心5 min，测定其α-葡萄糖苷酶抑制活性，选择对α-葡萄糖苷酶抑制率最高的蛋白酶。

1.3.5 响应面法优化超声波辅助酶法制备大豆降糖肽试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，以α-葡萄糖苷酶抑制率为响应值，通过响应面曲面分析进行制备条件的优化，并运用Design-Expert 8.0.6 Trial 软件分析得到最优制备条件。

2 结果与分析

2.1 蛋白水解酶筛选试验

图1 不同蛋白酶水解产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性

蛋白水解酶筛选试验结果见下页图1。从图1中可以看出，胰蛋白酶水解产物抑制率最高，木瓜蛋白酶最低；菠萝蛋白酶水解产物为负抑制率，其水解产物可能具有激活α-葡萄糖苷酶的作用。上述结果出现的原因可能是，由于碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶这3 种蛋白酶的酶切位点较为广泛导致产物多样；胰蛋白酶酶切位点较为专一特殊，酶切位点集中在Arg、Lys 为羧基端的肽键部分，由于这种专一而特殊的酶切位点，产生的多肽序列能够对α-葡萄糖苷酶分子产生抑制作用。因此，选择胰蛋白酶作为试验用酶。

2.2 响应面法优化大豆蛋白降血糖肽的制备工艺

2.2.1 酶解试验响应面分析

酶解试验响应面设计和结果见表1，用Design-Expert 8.0.6 Trial 软件分析，建立响应面的回归模型，分析结果见表2，响应面回归方程为：Y（%）=53.45+0.48X1+1.62X2+0.44X3+0.44X1X2+0.088X1X3+0.26X2X3－1.68X12－2.12X22－1.42X32。

表1 Box-Behnken 酶解响应面试验设计与结果

表2 酶解过程回归方程各项的方差分析

从表2 的方差分析可以得出回归方程的一次项和二次项极其显著，说明各因素对响应值的影响不是简单的一次线性关系。交互项极其显著，说明各因素之间的交互作用很好，整个响应面基于各因素间的交互作用构成。失拟项极其不显著，说明试验的误差很小。

2.2.2 超声预处理试验响应面分析

超声波试验响应面设计和结果见表3，通过建立响应面的回归模型，分析结果见表4。分析得到的响应面回归方程为：Y（%）=64.74+0.48X4+0.46X5+0.11X6+0.22X4X5－0.13X4X6+0.088X5X6－2.63X42－2.50X52－0.39X62。

表3 Box-Behnken 超声波预处理响应面试验设计与结果

表4 超声波预处理回归方程各项的方差分析

从表4 的方差分析可以得出α-葡萄糖苷酶抑制率方程的一次项和二次项中除X6、X62不显著，其余项极其显著，说明各具体因素对响应值的影响不是简单的一次线性关系。交互项不显著，因此说明各因素之间的交互作用较差，响应面因素选择需要在后续试验中进一步改善。失拟项极不显著，因此说明试验的误差很小。

2.2.3 响应曲面分析

通过响应曲面分析酶解时间（X1）、加酶量（X2）、酶解底物浓度（X3）；超声波处理时间（X4）、超声波功率（X5）、超声波预处理底物料液比（X6）对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响情况，结果分别见图2～图7。

由响应曲面图可以直观的分析各因素交互作用对α-葡萄糖苷抑制率的影响，曲线密集度越大或陡峭程度越高表明对抑制率得影响越大，因此在本试验条件参数范围内，酶解过程中，加酶量对抑制率的影响要大于酶解时间和酶解底物浓度的影响，酶解时间和加酶量的交互作用极显著，加酶量和底物浓度的交互作用显著；超声波预处理过程中，超声时间比超时功率和底物浓度对抑制率的影响显著。由响应曲面和等高线图以及回归方程分析可知，最佳制备条件为：酶解时间22.0 min、加酶量6 416.61 U/g、酶解底物浓度2.10%；超声时间20.9 min，超声功率245.9 W，超声底物浓度6.27%。在此条件预测抑制率达到64.82%。为验证模型可靠性，进行3 次验证，最终得大豆蛋白肽的抑制率为64.79%，与预测值基本一致。

图2 X1 及X2 对α-葡萄糖苷酶抑制率影响的响应曲面

图3 X1 及X3 对α-葡萄糖苷酶抑制率影响的响应曲面

图4 X2 及X3 对α-葡萄糖苷酶抑制率影响的响应曲面

图5 X4 及X5 对α-葡萄糖苷酶抑制率影响的响应曲面

图6 X4 及X6 对α-葡萄糖苷酶抑制率影响的响应曲面

图7 X5 及X6 对α-葡萄糖苷酶抑制率影响的响应曲面

3 结论

本试验采用响应面法分别优化酶解过程和超声波预处理辅助酶解过程，得到大豆蛋白肽的α-葡萄糖苷酶抑制率与未经超声波预处理的试验组比较，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了19.01%，这可能是超声波预处理对大豆蛋白的结构发生了影响。本试验为进一步开发大豆天然降血糖多肽提供了研究基础，为Ⅱ型糖尿病患者提供了新型降血糖多肽，也为大豆蛋白的综合利用提供新的方向。